四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织PI3K/Akt/mTOR 信号通路的免疫组化影响

王燕柳荣朱向东

(甘肃中医药大学,兰州 730000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种以大肠黏膜与黏膜下炎症为主要特征的慢性非特异性炎症性疾病,据统计UC 患者罹患结肠癌风险极高,对患者造成的危害及痛苦极大[1-2]。目前认为UC 的发病是外源物质引起宿主反应、基因和免疫影响三者相互作用的结果,其病程漫长,常反复发作。卢茂永[3]认为UC 缓解期以本虚为主,本病虚多表现为脾阳虚,也有兼肾阳不足的情况。任彦等[4]认为年老者、病程长者及病情严重或反复者,证素以脾、肾、湿、气虚为主,故脾肾阳虚是UC 常见的证型之一。四神丸为治疗脾肾阳虚之肾泄证(五更泻)经典方剂。明·王肯堂《证治准绳·类方》卷六在《证治准绳·类方》卷六有“治脾胃虚弱,大便不实,饮食不思,或泄泻腹痛等证。肉豆蔻二两、补骨脂四两、五味子二两、吴茱萸浸,炒一两上为末,生姜八两,红枣一百枚,煮熟取枣肉和末丸,如桐子大。每服五七十丸,空心或食前白汤送下”。研究发现四神丸及其方中单味药具有止泻、抑制肠蠕动、抗肿瘤、免疫调节、抗炎镇痛等作用[5-11]。四神丸治疗脾肾阳虚型UC 的具体分子机制尚不完全清楚,本实验通过研究四神丸对脾肾阳虚型UC 大鼠结肠组织病理改变,结肠组织中PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白免疫组化表达水平的影响来探讨四神丸治疗脾肾阳虚型UC 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

120只70d 龄SPF 级Wistar 大鼠,雌雄各半,体重(180 ± 20)g,甘肃中医药大学科研实验动物中心【SCXK(甘)2015-0002】。大鼠饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF 级屏障实验室【SYXK(甘)2015-0005】。饲养环境:实验室温度21 ～25℃,相对湿度50% ～60%,光照12 h/12 h 明暗交替,噪音＜50 dB。所有本研究中使用的实验方案由甘肃中医药大学动物管理委员会及动物福利伦理委员会批准,严格按照3R 原则进行动物饲养及实验(项目批准号:2018-081)。

1.1.2 药物

四神丸组方药物,购于兰州惠仁堂大药房,甘肃中医药大学中药鉴定中心鉴定合格,实验处方:补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大枣,制备方法:按照4 ∶1 ∶2 ∶2 ∶4 ∶4的比例称取补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大枣,将生姜、大枣先煎,去姜去枣核,将枣肉捣成泥,其余药物打粉,混入枣泥并搓成梧桐子大的水丸。使用时将四神丸水丸高、中、低剂量组分别按生药3.2、1.6、0.8 g/kg 剂量打粉,加适量热蒸馏水搅拌均匀后备用。番泻叶药剂制备:番泻叶,购于兰州惠仁堂大药房,甘肃中医药大学中药鉴定中心鉴定合格,将番泻叶按照大鼠体重10 g/kg 取定量的药材,加适量水煎煮,过滤药液使用旋转蒸发器将药液浓缩,浓度为1 g/mL,装入消毒过的药瓶,放入冰箱保存备用。美沙拉嗪药剂制备:购于葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司(批号170804),将美沙拉嗪肠溶片按大鼠体重0.36 g/kg 剂量打粉,加适量蒸馏水搅拌均匀后备用。氢化可的松注射液:购于国药集团容生制药有限公司(批号1708201)。2,4-二硝基苯磺酸:购于梯希爱(上海) 化成工业发展有限公司(批号FHB01-NRAJ)。

1.1.3 主要试剂与仪器

兔SP 试剂盒(中杉金桥公司,SP-9001),HE染色试剂盒(索莱宝,G1120),苏木素(索莱宝,1140),p-AKT Ser473(CellSignaling,4060S),mTOR(CellSignaling, 2983S), PI3K p85 (ImmunoWay,YT3711),p-mTOR Ser2448(ImmunoWay,YP0176),p-PI3K p85(abcam,GR194710-78),β-actin(abcam,GR3255609-1),AKT(GeneTex,43264)。

H1650R 型台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司,中国),2016 型切片机(LEICA,德国),KD-T 电脑生物组织摊烤片机(科迪仪器设备有限公司,中国),KD-BM 生物组织包埋机(科迪仪器设备有限公司,中国),BI2000 免疫组化分析系统(泰盟软件有限公司,中国),iMark 酶标仪(Bio-Rad,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模

参照文献方法采用病证结合法使用DNBS/乙醇溶液灌肠+ 皮下注射氢化可的松+ 番泻叶灌胃建立脾肾阳虚型UC 大鼠模型[12]。对SPF 级Wistar大鼠进行番泻叶灌胃10 mL/(kg·d),配合氢化可的松皮下注射10 mg/(kg·d),每日1 次,连续21 d。21 d 后,禁食24 h,腹腔麻醉,使用注射器配16 号灌胃针经肛门插入到达结肠部位,注射时将肛门捏紧,将DNBS/乙醇溶液(每只25 mg DNBS + 50%的乙醇0.25 mL)缓慢注入大鼠肠腔内,完全注入药液后再注入1 mL 空气,捏取大鼠尾巴使大鼠保持倒立状态1 min,使药液与结肠充分接触,结束后拔出灌胃针,待麻醉清醒后继续正常喂养。

1.2.2 大鼠的分组与给药

将120 只Wistar 大鼠适应性喂养7 d 后,随机抓出20 只作为空白组,其余100 只进行造模。造模成功后,将剩余成功建立模型的大鼠随机分为模型组、阳性对照(美沙拉嗪)组、四神丸高剂量组、四神丸中剂量组、四神丸低剂量组。空白组和模型组灌服蒸馏水,美沙拉嗪组按生药0.36 g/kg 剂量灌胃,四神丸高、中、低剂量组分别按生药3.2、1.6、0.8 g/kg剂量灌胃,灌胃量均为10 mL/kg。各组灌胃每日1 次,连续21 d。

1.2.3 标本采集

大鼠给药治疗21 d 结束后,各组大鼠禁食不禁水1 d,注射麻醉,颈椎脱臼法处死大鼠。用组织剪剪下大鼠结肠组织,纵剪剖开,截取大鼠结肠病变最严重处组织,剪去组织周边多余脂肪,用预冷过的生理盐水反复冲洗干净,放滤纸上吸干液体,将结肠组织置于装有4%多聚甲醛溶液的玻璃瓶中固定保存,用于苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin Staining,HE)染色以及链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(Streptavidin-perosidase,SP)实验。

1.2.4 各组大鼠结肠组织病理学改变

将固定在4%多聚甲醛溶液中的结肠组织取出,用PBS 缓冲液进行冲洗,乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋后制成石蜡切片后,依次进行脱蜡→水化→苏木素染色→伊红染色→脱水封片→显微镜进行下拍照观察。

1.2.5 SP 免疫组化法检测结肠组织中PI3K p85、p-PI3K p85、 Akt、 p-AKT Ser473、 mTOR、 p-mTOR Ser2448 蛋白表达水平

将固定于4%多聚甲醛溶液中的结肠组织取出进行石蜡包埋后制成石蜡切片后,依次进行脱腊→水化→抗原修复→正常血清封闭→滴加PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 抗体→DAB 显色→复染→返蓝→梯度酒精脱水→透明封片→通过图像分析系统观察分析PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 的蛋白表达位置及平均光密度值。

1.3 统计学分析

实验所得的计量资料采用SPSS 21.0 软件进行统计处理。若数据符合正态分布以平均值± 标准差(±s) 表 示, 采 用 单 因 素 方 差(One-way,ANOVA)分析,方差齐时组间比较用最小显著法(least significant difference,LSD)检验,方差不齐选用Tamhane’s T2 检验;若数据不符合正态分布,则用中位数和四分位数间距表示,用W-H 秩和检验统计分析。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织病理学改变

空白组:染色均匀,细胞核清晰可见,肠黏膜层结构完整(红色箭头),基层腺体(黑色箭头)分布均匀。模型组:与空白组相比较,染色清晰均匀,细胞结构清晰可见,肠黏膜部分消失(红色箭头),腺体消失(黑色箭头),有大量的炎性细胞浸润(蓝色箭头),聚集于黏膜层和基层。治疗组:与模型组相比较,药物组炎性细胞减少(蓝色箭头),黏膜层结构不同程度的恢复正常(红色箭头),美沙拉嗪组和四神丸中剂量组效果最好,黏膜结构接近空白对照组。四神丸低剂量组与模型组相比,炎性细胞稍有减少(蓝色箭头),可见少量的腺体结构(黑色箭头),黏膜层虽被炎性细胞侵润,损伤严重但腺体结构可见(见图1)。

图1 各组大鼠结肠病理形态Figure 1 Pathological morphology of colon in each group

图2 各组大鼠结肠组织中PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448蛋白平均光密度值柱状图(±s,n =8)Note. Compared with the model group, △P＜0.05, △△P＜0.01. Compared with the mesalazine group, ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01.Figure 2 Histogram of average optical density values of PI3K p85, p-PI3K p85, Akt, p-AKT Ser473, mTOR,p-mTOR Ser2448 protein in colon tissue of rats in each group(±s,n=8)

2.2 各组大鼠结肠组织中PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白的定位表达水平

与空白组相比,模型组PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值显著升高(P＜0.01)。与模型组相比,PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值在四神丸高、中、低剂量组及美沙拉嗪组均有不同程度下降,有显著性差异(P＜0.01,P＜0.05)。与美沙拉嗪组比较,四神丸高剂量组Akt 蛋白平均光密度值显著高于美沙拉嗪组(P＜0.01),p-PI3K p85、p-AKT Ser473、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪组(P＜0.05),PI3K p85、mTOR 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪组,但无显著性差异(P＞0.05);四神丸低剂量组p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值显著高于美沙拉嗪组(P＜0.01),PI3K p85 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪组(P＜0.05);四神丸中剂量组PI3K p85、p-PI3K p85、 Akt、 p-AKT Ser473、 mTOR、 p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪组,但无显著性差异(P＞0.05)(见图2、3)。

图3 各组大鼠结肠蛋白免疫组化结果Figure 3 Immunohistochemical results of protein in colon of rats in each group

3 讨论

近年来,UC 在我国发病率明显增高,其中病程长且病变范围广泛者癌变危险性极高,对患者造成极大的危害[1-2]。UC 病位在大肠,但病机关键是脾虚,病程较长或反复发作的UC 发展过程常见脾肾两虚。从中西医结合角度来看,阳气虚证病人机体免疫力也相应低下,致使吞噬系统紊乱,而很多补益药都已证实有增强免疫力,加速吞噬细菌、毒素机能,控制炎症的作用[12]。西药治疗UC 价格昂贵,副作用大,且无法根治反复发作。中医复方从中医整体观念上对UC 进行整体调节具有副作用少、治疗后不易反复发作等优势。临床上,四神丸治疗脾肾阳虚型UC 疗效确切,可修复肠道黏膜损伤,治疗肠道病变,缓解或治愈UC 相关症状[13-15]。四神丸相关的实验研究也进一步证实,四神丸可修复肠黏膜屏障,抑制炎症反应,改善胃肠道功能[16]。

PI3K/Akt/mT0R 信号通路在代谢、炎症、肿瘤等疾病发生中发挥重要作用。研究[17-22]发现PI3K/Akt/mT0R 信号通路影响细胞增殖、分化和凋亡,在肠道炎症及肿瘤反应中起着重要作用,认为PI3K/Akt/mT0R 信号通路可能同时参与了UC 的炎症及癌变过程。通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路亦能够诱导巨噬细胞自噬从而抑制炎症反应[23]。现代药理学表明[10,11,16,24-26],四神丸可抑制炎症通路过度激活,能一定程度的阻止癌变,恢复机体免疫平衡,修复肠黏膜屏障,抑制肠道推进作用。其中单味药均具有不同程度的止泻、抗炎、免疫调节等作用,可有效治疗UC。本研究以PI3K/Akt/mTOR 信号通路对UC 的影响为切入点,进一步探讨四神丸治疗脾肾阳虚型UC 可能的分子机制。

本实验结果显示,模型组结肠组织肠黏膜部分消失,腺体消失,有大量的炎性细胞浸润,聚集于黏膜层和基层;而黏膜损伤可能与PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值显著升高有关。经药物预后与模型组比较,药物组炎性细胞减少,黏膜层结构不同程度的恢复正常;同时PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值在四神丸高、中、低剂量组及美沙拉嗪组均有不同程度下降。其中以美沙拉嗪组和四神丸中剂量组改变最为明显,这说明四神丸可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活,进而调控炎症因子,调节机体免疫、自噬,从而修复肠道黏膜损伤。