低氧对斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的抑制作用

楚璐萌田子颖崔蕊吴娇于海川

(1. 新乡医学院医学检验学院,河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心,河南 新乡 453003;2. 新乡医学院药学院,河南 新乡 453003; 3. 新乡医学院第二附属医院,河南省生物精神病学重点实验室,河南 新乡 453002; 4. 河南省郑州市第七人民医院,郑州 450000)

斑马鱼(Danio rerio)是研究发育、造血和遗传学的强大模型[1],其具有体外受精发育、产卵量大、胚胎透明等多种优势[2-4]。斑马鱼与人类之间的遗传同源性达87%[5],同时具有遗传操作和再生能力[6],这使得斑马鱼成为目前研究脊椎动物胚胎发育和造血分化的优秀动物模型[7]。低氧是影响水生系统的最重要的压力源之一[8-9],目前有关低氧对斑马鱼胚胎发育的影响机制研究报道非常少。斑马鱼胚胎发育是一个复杂的、高度协同的过程。斑马鱼与人的造血分化是保守一致的,已经发现并克隆了造血过程中的阶段特异性表达基因,包括EPO、Globin 和GATA1 等[3,10]。研究发现红细胞生成受到低氧环境的影响,其中一个或多个异常可能导致不同类型的红细胞生成障碍[10]。本文采用联苯胺染色、邻联茴香胺染色及瑞氏吉姆萨染色来显示红细胞的生成及形态学变化,观察了低氧下斑马鱼胚胎的整个发育过程,并对常氧和低氧下的基因表达水平进行了比较,从而加深了低氧对脊椎动物影响的认识。目前涉及低氧对斑马鱼影响的详细研究很少,本研究为揭示低氧影响斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的具体过程提供了新数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本实验得到新乡医学院动物实验伦理委员会的审批(XYLL-2020163),于河南省免疫与靶向药物重点实验室中进行实验,实验动物实验使用许可证号【SYXK(豫)2018-0014】。约100 对状态良好的生育期的AB 品系斑马鱼养殖于上海海圣斑马鱼实验养殖系统中,光照/黑暗14 h/10 h,水温为28℃。受精卵在28.5℃下孵育,并根据Kimmel 等[2]方法进行分期。

1.1.2 主要试剂与仪器

3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(MACKLIN,中国);瑞氏吉姆萨染液(Baso,中国);AO 染液(索莱宝,中国); 邻 联 茴 香 胺(Sigma, 美 国); TRIzol 试 剂(ambion,美国);逆转录试剂盒(诺唯赞,中国)。

斑马鱼养殖系统(上海海圣生物实验设备有限公司,中国);YCP 系列三气培养箱(长沙华曦电子科技有限公司,中国);ZEISS Discovery.V8 体式荧光显微镜(ZEISS,德国);BX51 正置荧光显微镜(Olympus,日本);PikoRealTM实时荧光定量PCR 检测仪(Thermo Fisher Scientific,美国);Tanon-3500 凝胶成像系统(上海天能公司,中国)。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼的繁殖和胚胎处理

斑马鱼是根据已有文献的标准条件饲养和繁殖[11],交配和胚胎培养方法由中国斑马鱼资源中心提供。12 hpf(hours post fertilization)后收集高质量的胚胎进行实验。将胚胎分为低氧和常氧培养组,低氧组的胚胎暴露于5% O2浓度下。每12 h 收集1 次斑马鱼胚胎,鉴定胚胎的发育阶段。在不同发育时期,从常氧和低氧组各随机选取10 个胚胎,用ZEISS ZEN 软件计算卵黄囊的比例;用Image J 软件分析体表色素沉着的比例;在体视显微镜下观察并计算胚胎个体的心率。

1.2.2 联苯胺染色和邻联茴香胺染色

联苯胺染色按照本实验室的方法进行[12],邻联茴香胺染色参照文献方法进行[13]。使用体式显微镜对各发育阶段的胚胎进行观察并拍照,用Image J软件分析整个斑马鱼中染色部分的占比。图像至少是从3 个独立的实验中获得,每组至少有6 个胚胎或幼鱼。

1.2.3 瑞氏吉姆萨染色

对胚胎进行断尾处理收集血细胞,制备血涂片。斑马鱼预处理及瑞氏吉姆萨染色方法参照文献进行,并稍作改进[14-15]。使用BX51 正置荧光显微镜观察并鉴定红细胞类型,并依据统计学方法计算红细胞在所有血细胞中的比例。

1.2.4 AO 染色

随机收集10 个胚胎/幼鱼移至包含1 mL ddH2O 的EP 管中,然后加入30 μL 10 μg/mL 的AO 染液,避光染色1 h[16-17]。立即使用体式荧光显微镜观察并拍摄胚胎中的荧光。

1.2.5 RNA 提取和Real time PCR

每组随机取50 个胚胎/幼鱼,溶于TRIzol 试剂中提取总RNA。使用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA。使用特异性基因引物(见表1)进行常规RT-PCR 和Real time PCR。

表1 实时荧光定量PCR 引物名称及序列Table 1 Primer names and sequences of Real time PCR

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 7 软件对实验数据进行分析。计量资料以平均值± 标准差(±s)表示,采用t检验比较两组样本的均值,多组间的样本采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧延迟斑马鱼胚胎发育

依据前期实验结果,最终选定5% O2浓度作为低氧条件。将12 hpf 的斑马鱼胚胎(图1A)随机分为两组,分别在常氧和低氧下培养。24 hpf,咽囊期原基-5 期视网膜色素沉着和皮肤黑色素沉积较早,卵黄囊内出现红细胞,此时出现早期心脏搏动(图1B);36 hpf,原基-25 期,绒毛膜中的斑马鱼胚胎出现早期运动、尾部色素沉着和血液循环(图1C);48 hpf,长胸鳍期,卵黄囊开始变薄,侧边带出现黑素细胞,视网膜上的虹膜色素细胞丰富,头部出现黄色(图1D);60 hpf,高胸鳍期,血液循环明显,视网膜虹膜色素细胞环加深(图1E);72 hpf,孵化期的突口阶段,虹膜色素细胞覆盖眼睛,背部与头部相同颜色(图1F);84 hpf,斑马鱼胚胎已经发育到幼鱼期(图1G)。低氧下,胚胎在24 hpf 时发育到卵裂期的20-体节阶段,在胚胎背侧区域共观察到20个体节,相当于在常氧下19 hpf 时的发育阶段(图1H)。同样,低氧下,36、48、60、72、84 hpf 的胚胎发育阶段分别为原基-6 期、原基-25 期、高胸鳍期、长胸鳍期和胸鳍期,分别与常氧下的25、36、42、48、60 hpf 一致(图1I、1J、1K、1L、1M),即低氧在一定程度上延迟了斑马鱼胚胎的整体发育。

2.2 低氧对于斑马鱼卵黄囊、色素沉着、胚胎孵化和心率的影响

在相同发育阶段,低氧组斑马鱼的卵黄囊体积明显大于常氧组(图2A、2B);低氧组斑马鱼眼睛、头部、躯干和卵黄囊中的色素沉着明显低于常氧组(图2A、2C);在相同的长胸鳍阶段,常氧组胚胎完成了孵化,低氧组胚胎仍然包裹在绒毛膜中(图2A)。常氧组斑马鱼在24 hpf 时胚胎开始出现早期的心脏搏动,而此时低氧组未发现心脏搏动。从24 hpf 开始,无论是否低氧培养,胚胎早期心率随时间变化趋势一致,约60 hpf 后心率趋于稳定,而在相同发育时间,低氧组斑马鱼胚胎心率明显低于常氧组(图2D)。另外,相同发育阶段,低氧下的胚胎心率明显低于常氧(图2E)。

2.3 低氧减少斑马鱼早期胚胎发育红细胞的生成

邻联茴香胺染色结果显示,经低氧处理的斑马鱼胚胎的邻联茴香胺的着色面积显著降低,染色部位主要位于卵黄囊,而常氧组斑马鱼胚胎的染色部位则逐渐从卵黄囊转移到心脏和头部(图3A-a, c,e, g)。联苯胺染色结果与邻联茴香胺染色基本一致,常氧下胚胎的主要染色部位逐渐从卵黄囊和大血管转移到心脏、大血管和节间血管,低氧下的染色部位逐渐从卵黄囊转移到心脏和血管,节间血管染色不明显(图3B)。使用Image J 软件对联苯胺染色结果进行分析,在同一发育阶段,低氧下胚胎的着色面积比例明显低于常氧(图3C)。AO 染色结果显示,低氧下斑马鱼胚胎卵黄囊的前部和上部有大量的凋亡细胞(绿色荧光颗粒);但其会随着斑马鱼胚胎的发育逐渐减少(图3A-b, d, f, h)。

图1 斑马鱼胚胎发育代表性图片(× 150)Figure 1 Representative images of zebrafish embryonic development(× 150)

图2 低氧对于斑马鱼胚胎卵黄囊、色素沉着和心率的影响Note. A. Representative images of zebrafish embryos(× 150). B,C. The proportion of yolk sac volume and the proportion of pigmentation. D.The heart rate of zebrafish embryos under normoxic and hypoxic conditions at different developmental time. E. The heart rate of zebrafish embryos under normoxic and hypoxic conditions at the same developmental stage. Compared with normal oxygen, ∗P＜0.05, ∗∗P＜0.01,∗∗∗P＜0.001.(The same in the following figures)Figure 2 Effects of hypoxia on yolk sac, pigmentation and heart rate of zebrafish embryos

2.4 低氧抑制红细胞成熟

瑞氏吉姆萨染色结果显示,同一发育时期,低氧下斑马鱼的总红细胞(包括幼稚红细胞和成熟红细胞)比例低于常氧(图4A、4B)。图4A 中,蓝色箭头处为未成熟红细胞,胞体呈圆形,胞质丰富,细胞核呈圆形或类圆形,蓝色,多居中;红色箭头处为成熟的红细胞,胞体比未成熟红细胞小,呈椭圆形,胞质丰富,细胞核呈椭圆形,深紫色。低氧下84 hpf 的斑马鱼血液中只有未成熟的红细胞存在。但是同一发育阶段下常氧和低氧相比较,红细胞总数的比例没有统计学意义(图4C)。以往的研究表明,斑马鱼血液中的红细胞呈连续性年龄分布,成熟的红细胞血红蛋白含量较高[18]。这些结果表明低氧在一定程度上抑制了红细胞的成熟。

图3 低氧对斑马鱼胚胎血红蛋白的生成和细胞凋亡的影响Note. A. O-dianisidine staining pictures and Acridine orange staining pictures of zebrafish embryos(× 150). B. Representative benzidine staining of zebrafish embryos(× 100). C. Quantitative line chart of Benzidine staining.Figure 3 Effects of hypoxia on hemoglobin production and cell apoptosis of zebrafish embryos

图4 低氧抑制红细胞成熟Note. A. May-Grunwald Giemsa staining of zebrafish embryonic blood cells(× 1000). B. The proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos at different developmental time. C. At the same developmental stage, the proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos.Figure 4 Hypoxia inhibits red blood cell maturity

2.5 低氧对于斑马鱼胚胎发育过程中造血相关基因表达的影响

通过绘制斑马鱼胚胎发育早期的造血细胞分化发育图谱,我们选定了部分重要的造血相关基因进行表达检测。首先使用RT-PCR 的方法观察了在正常培养过程中斑马鱼胚胎发育6、12、24、48、72 hpf时一些重要造血相关基因的表达情况(图5A),在24 hpf 之后,红系特异性造血因子GATA1 和Globin 随着发育时间的增加其表达强度逐渐增加;同时其他的与造血相关的基因c-myc、scl、GATA2 和NFIL3 等在斑马鱼胚胎发育早期,也随着发育时间呈逐渐升高的趋势,而l-plastin 在早期的表达更加明显。另外,Real time PCR 结果显示了常氧和低氧下一些红系相关基因的表达差异。Globin 在相同的发育时期低氧下的表达强度要明显低于常氧下的表达强度,与之相反Epo 基因在低氧下则显示较高,同时其他相关造血基因在某些发育阶段也显示出低氧下表达强度低于常氧下(图5B)。这些基因表达的变化情况证实并解释了先前观察到的低氧抑制斑马鱼胚胎早期红系分化的结果。

图5 低氧对于斑马鱼胚胎发育中基因表达的影响Note. A. Some mRNA level was analyzed by RT-PCR during embryonic development of zebrafish. B. Real time PCR was employed to analyze the differential expression of hematopoietic related mRNA.Figure 5 Effects of hypoxia on gene expression in embryonic development of zebrafish

3 讨论

为了探讨低氧对斑马鱼胚胎发育和造血作用的影响,我们使用了不同的低氧浓度和低氧处理时间。前期的实验结果表明当受精后的胚胎直接暴露于1% O2浓度下超过24 h,死亡率几乎是100%。我们最终选定了5% O2浓度作为最适低氧浓度,而12 hpf 作为最佳低氧处置时间。斑马鱼胚胎是一个“封闭系统”,且发育早期不能合成血红蛋白来供应自身氧气的需求,只能通过外界氧气的被动扩散才能满足斑马鱼胚胎的正常生长发育,所以绒毛膜上的孔洞是氧气和营养物质从外部水环境运输到胚胎和清除废物所必需的[19],通过独特的绒毛膜结构,未孵化的胚胎感受到低氧并影响其发育,本研究发现低氧延缓了斑马鱼的孵化时间。卵黄囊的主要作用是为斑马鱼早期发育提供所需的营养物质,使发育不受外界干扰[20]。但有研究发现抵抗动物缺氧的最重要的防御机制之一是能量消耗的下调[21],本实验结果显示:低氧下斑马鱼胚胎卵黄囊的体积占比大于常氧,即实验证实低氧抑制卵黄囊的消耗。同时低氧减少了胚胎的体外色素沉着,这可能是由于低氧降低细胞色素P450 的表达[22],或者因为低氧影响了酪氨酸酶的活性从而延迟了胚胎色素细胞的发育[23]。总之,低氧从整体上抑制了斑马鱼胚胎的发育过程,而持续的低氧不利于胚胎发育和生物学进化,在某些情况下甚至可能导致严重的疾病或死亡。鱼类心脏对多种环境因素敏感,其中之一就是低氧。在低氧状态下,由于外部氧气浓度较低,通过绒毛膜被动扩散进入斑马鱼胚胎的氧气含量无法满足斑马鱼胚胎心脏形成和发挥功能的需求,从而导致其出现持续性心动过缓,通过降低心率和能量消耗从而提高成活率[24]。与文献报道相一致,本研究发现低氧会导致斑马鱼心率发生复杂的变化,其确切的变化取决于发育阶段,并且在较小的程度上取决于饲养温度[25]。同时,以往文献显示,低氧导致斑马鱼胚胎出现一定程度的心包水肿,伴有卵黄囊水肿,胚胎血管系统发育不良,血液流速变缓[26-28]。我们的研究结果再一次证实了这一结果,心包水肿影响血液循环、心率,并很可能对血细胞生成有一定影响。

低氧不仅影响斑马鱼胚胎的形态和心脏功能,造血分化和红细胞生成也受到了影响。斑马鱼是研究胚胎红细胞生成的理想系统[29]。红细胞的产生在许多水平上受到调节,包括基因表达的控制,环境条件的改变。本研究结果显示胚胎发育早期低氧对红细胞产生和成熟具有抑制作用。这可能是由于在胚胎发育的早期,低氧下卵黄囊前部和上部的血供不足引起的细胞凋亡,但在发育后期斑马鱼胚胎出现低氧耐受,凋亡模式发生改变,细胞凋亡数量减少。为了揭示低氧对红细胞生成过程中基因表达可能存在的调控机制,我们检测了一些重要的造血相关基因。有研究表明斑马鱼胚胎发育后期,12 hpf 胚胎血红蛋白的表达水平开始增加,并在孵化前后达到高峰,且胚胎血红蛋白基因水平一直保持在高水平,直到成年[30]。本实验的初步结果表明,常氧下12 hpf,红系特异性造血因子Globin 开始表达,随着发育时间的增加其表达强度逐渐增加,这与已有的研究报道结果是一致的;但是低氧下Globin 的表达水平降低,及HiF1α 的表达水平升高,提示在斑马鱼胚胎发育早期,低氧确实影响基因表达,但其分子机制尚不清楚。据报道,低氧可以通过调节斑马鱼胚胎的HIF 通路,影响斑马鱼胚胎造血干细胞的产生和造血末期红细胞的终末分化[31-33]。

综上所述,低氧延缓了斑马鱼胚胎的发育,抑制了红细胞的产生和成熟。我们的结果加深了人们对低氧诱导脊椎动物产生影响的认识,同时也提供了低氧对斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的最新认识。由于斑马鱼相对于小鼠模型具有许多优势,斑马鱼疾病模型的进一步发展将加速我们对疾病各种病理、生理过程的了解。随着斑马鱼疾病模型的可用性和日益增加的多样性,该动物系统将为疾病诊断,有效治疗和预后提供强大的基础。在高海拔地区,低氧与中风或癌症等疾病相关[34]。所以此项研究在一定程度上为探索临床上低氧性疾病提供了新的认识和见解,但低氧究竟如何影响斑马鱼的胚胎发育和造血分化,还有待进一步研究。