长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展

李凌巍，吕 浩，刘熙称，秦俊杰

1.吉林大学第一医院肝胆胰内科，吉林 长春 130021；吉林大学第一医院二部急救医学科

近年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势，2015年我国胰腺癌发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤第9位和第6位[1]。尽管胰腺癌的综合治疗领域不断出现新的进展，但在改善患者预后方面仍然收效甚微，5年生存率仍不足8%。因此，为提高患者早期诊治率、改善预后，探索胰腺癌发病的分子机制，寻找早期诊断、预测预后的分子标志物及新的治疗靶点成为亟待解决的问题。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度>200个核苷酸的非编码RNA的总称，由于缺乏完整的开放阅读框而几乎不具有蛋白质编码功能，既往被认为是基因转录中的“垃圾序列”[2]。随着国内外对基因组学研究的深入，lncRNA潜在的生物学功能被不断发掘。目前研究发现，lncRNA可通过转录水平、表观修饰水平和转录后水平三个层面调控转录后基因的表达[3]。近年来，lncRNA成为肿瘤发生发展机制中的热点问题，在肿瘤病理过程的多项环节中均起到重要的调节作用[4]。目前关于lncRNA的研究不断深入，但绝大多数lncRNA的功能仍不明确。本文总结近年来胰腺癌相关lncRNA的研究进展，以阐明其在胰腺癌发生发展和判断预后及靶向治疗上的应用。

1 lncRNA在胰腺癌发生发展中的作用

1.1 lncRNA促进胰腺癌的发生发展

1.1.1 lncRNA促进胰腺癌细胞的增殖、抑制其凋亡：增殖迅速、凋亡减少是肿瘤细胞的一个重要特点，研究发现lncRNA与之密切相关。Cai等[5]研究发现，HOTAIR可破坏miR-663b启动子区域H3K4me3和H3K27me3之间的平衡，诱导miR-663b启动子超甲基化，限制其对胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的抑制，进而促进胰腺癌细胞的增殖和迁移，减少胰腺癌细胞的凋亡。Li等[6]研究发现，zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能通过诱导miR-34a启动子异染色质的形成抑制其表达。这一过程依赖于HOTAIR将EZH2引导到其目标基因组区域，EZH2-HOTAIR复合物能够特异性地结合miR-34a的CpG岛，进而降低miR-34a的表达，抑制其在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中的抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞、凋亡和衰老的作用。MIR155HG在胰腺癌肿瘤组织和细胞系中的表达相对于邻近的正常组织和细胞明显增强。敲除MIR155HG基因强烈地抑制了胰腺癌细胞的增殖，诱导了细胞周期阻滞，并进一步促进了胰腺癌细胞的凋亡。MIR155HG在胰腺癌中的促癌作用是通过对下游效应器miR-802的负调控实现的[7]。LINC01207是在胰腺癌中高表达的一种lncRNA，研究[8]发现，沉默LINC01207后，下游靶点miR-143-5p的表达水平升高，前梯度蛋白2(anterior gradient protein-2，AGR2)表达降低。LINC01207/miR-143-5p/AGR2轴可能作为胰腺癌发生的部分机制，LINC01207可通过该机制促进胰腺癌细胞的生长，抑制其自噬和凋亡。Cheng等[9]研究发现，SNHG7敲除在体外抑制胰腺癌细胞的增殖和转移；在小鼠胰腺癌模型中，体内敲低SNHG7可抑制肿瘤的生长。机制上，在胰腺癌中SNHG7可作为miR-342-3p的竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)从而正向调节DNA结合抑制因子4(inhibitor of DNA binding 4，ID4)发挥促癌作用。上述lncRNA的异常表达促进胰腺癌细胞的增殖，抑制其凋亡，提示这些lncRNA或可作为胰腺癌的治疗靶点。

1.1.2 lncRNA促进胰腺癌细胞的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程：EMT是指上皮细胞通过特定生物学程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在这一过程中，上皮细胞失去极性及细胞间的紧密连接，转变为具有迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质能力的间质表型。EMT可促进肿瘤细胞的迁移与侵袭，促进肿瘤疾病的进展，研究发现lncRNA参与促进胰腺癌细胞的EMT[10-11]。Zhao等[10]研究发现，将胰腺癌细胞株SW1990给予低氧刺激后，NORAD表达水平显著升高。通过siRNA技术敲除NORAD后，间充质细胞标记N-钙黏蛋白、波形蛋白和E盒结合锌指蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)的表达水平显著降低，上皮细胞标记E-钙黏蛋白的表达水平增加，细胞的EMT受到抑制。小G蛋白超家族的亚家族成员RhoA蛋白在细胞EMT过程中起到至关重要的作用，该研究证实NORAD通过作为hsa-miR-125a-3p的ceRNA调节RhoA蛋白的表达，促进胰腺癌细胞的EMT。该研究为lncRNA在缺氧诱导肿瘤细胞EMT中的作用提供了理论支持。Shen等[11]研究证实，XIST在胰腺癌组织中表达水平显著高于正常组织，XIST可作为ceRNA海绵化miR-429，使ZEB1的表达水平升高。伤口愈合实验和穿孔实验分别观察到XIST的敲除显著抑制了PANC-1和AS胰腺癌-1细胞的迁移和侵袭；同时上调了使上皮标志物(E-钙黏蛋白和Claudin-1)的表达升高，并抑制了间质标志物(β-连环蛋白和Snail因子)的表达。EMT是肿瘤疾病转移的重要机制，我们或可通过调低上述lncRNA的表达水平，逆转EMT过程，抑制胰腺癌的发展进程。

1.1.3 lncRNA促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭：迁移性和侵袭性是肿瘤细胞的重要特性，也是决定肿瘤疾病恶性程度的重要因素。lncRNA可通过促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭参与胰腺癌的进展。UCA1最初发现于膀胱癌组织，其过表达显著增强了膀胱癌细胞在体内外的致瘤性和侵袭性[12]。Zhang等[13]研究发现，在胰腺癌组织中UCA1的表达水平显著高于癌旁胰腺组织，UCA1与Hippo途径的关键蛋白Lats1、MOB1和YAP相互作用形成核糖核蛋白复合物，通过Hippo途径促进胰腺癌细胞的转移和侵袭。此外，多项研究[14-16]发现，UCA1分别作为不同miRNA的分子海绵，调控其下游靶基因从而调节胰腺癌细胞的迁移、侵袭和细胞周期。Yao等[17]研究发现，DANCR通过作为miR-214-5p的ceRNA促进胰腺癌细胞的生长和转移，并正向调节胰腺癌细胞中E2F2基因的表达。最新研究[18]表明，E74样ETS转录因子3(E74 like ETS transcription factor 3，ELF3)在胰腺癌组织中表达上调，在胰腺癌中起癌基因作用。NEAT1可通过与RNA结合蛋白IGF2BP1结合，进一步促进IGF2BP1与ELF3 mRNA的结合，从而抑制ELF3 mRNA降解，增加其稳定性。体外实验证实，NEAT1表达水平升高促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。裸鼠胰腺癌模型实验中，敲除NEAT1后观察到肿瘤生长速度更慢，且相对对照组肺转移结节灶明显减少。降低肿瘤的迁移性与侵袭性可改善肿瘤患者的预后，因此，上述lncRNA可作为胰腺癌新药的治疗靶点，抑制胰腺癌细胞的迁移与侵袭，增加胰腺癌患者的生存率。

1.1.4 lncRNA参与维持肿瘤干细胞的特性：肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)占肿瘤细胞的一小部分，具有无限自我更新和不对称分裂的能力[19-20]。有学者[21]发现，在血液系统恶性肿瘤和包括胰腺癌在内的实体肿瘤中，CSCs可能在肿瘤的侵袭、转移、复发、化疗抵抗和总体生存中发挥重要作用。lncRNA与胰腺癌肿瘤干细胞(pancreatic cancer stem cells，PCSCs)关系密切。Jiao等[22]发现，MALAT-1在PCSCs中表达上调，并能增加胰腺癌细胞中CSCs的比例。CSCs成球实验表明MALAT-1敲除可显著减少肿瘤球体的形成，说明MALAT-1在PCSCs的调控中起重要作用，对维持PCSCs的自我更新能力是必需的。Fu等[23]研究发现，Hottip在PDAC细胞系和PDAC组织中的胰腺癌SCs中表达上调。Hottip通过与WDR5结合促进HOXA9的表达，而敲除HOXA9使PCSCs球体形成被抑制。进一步探究其机制，Hottip-WDR5-HOXA9轴通过Wnt/β-catenin通路维持PCSCs的干性。消除CSCs的干性可能延缓肿瘤疾病的进展，改善耐药，提高患者的生存率，lncRNA或许可以作为一个靶点，但此设想的临床应用还需深入相关研究进一步证实。

1.2 lncRNA抑制胰腺癌的发生发展绝大多数lncRNA在胰腺癌的发生发展中扮演原癌基因的角色，但也有少量lncRNA可抑制胰腺癌的发生发展。2013年，Lu等[24]首次证实，GAS5在胰腺癌组织中表达水平降低，过表达的GAS5可抑制胰腺癌细胞增殖，而抑制GAS5使胰腺癌细胞G0/G1期比例减少，S期比例增加。进一步探讨其机制，体内外实验均表明GAS5可负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases 6，CDK6)从而调节胰腺癌细胞周期，进而抑制胰腺癌细胞增殖。近年来也有研究发现，GAS5分别作为miR-32-5p、miR-221的ceRNA，正向调节PTEN蛋白、细胞因子信号传导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表达，抑制胰腺癌细胞的增殖与迁移，发挥抗肿瘤作用[25-26]。MEG3在胰腺癌组织中表达显著降低，在PANC-1细胞中敲除MEG3可增加S期的细胞比例，促进细胞增殖，并增强细胞的集落形成能力。同时，MEG3表达水平的降低还可使EMT过程中的上皮细胞标记E-钙黏蛋白表达降低，间充质细胞标记N-钙黏蛋白、波形蛋白及Snail因子表达上调，因此抑制MEG3可促进胰腺癌细胞的EMT过程，增强细胞的迁移能力[27]。此外，近年来也有研究[28]发现，MEG3作为miR-148a的下游靶点，参与调节Wnt/β-catenin信号通路从而抑制胰腺癌的侵袭和转移。Qin等[29]通过在胰腺癌BxPC-3细胞中过表达DAPK1发现，BxPC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力随着DAPK1表达水平的升高受到抑制，这一过程可能是通过下调磷酸化Akt和磷酸化ERK1/2的表达，调节PI3K/Akt和ERK途径实现的。Xu等[30]收集60例胰腺癌临床病理资料发现，DAPK1表达与肿瘤分化程度和淋巴结转移呈负相关。此外，DAPK1过表达可降低miR-182表达水平，同时抑制ROCK-1和RhoA蛋白表达，影响细胞骨架的改变，提示其通过ROCK-1/RhoA信号通路调节miR-182，从而调节胰腺癌细胞的侵袭和迁移。近年来也不断发现新的在胰腺癌中起到抑癌作用的lncRNA，如LINC00261[31]、PCTST[32]、PXN-AS1[33]等。以上抑癌lncRNA的发现，或为探索新的胰腺癌的治疗策略提供了分子水平的理论基础，但此设想应用于临床还需进行大量的更深入的研究。

2 lncRNA对胰腺癌细胞耐药性的影响

目前胰腺癌在治疗方面的主要手段是手术和化疗，吉西他滨为胰腺癌的一线化疗药物。但由于化疗过程中易产生耐药性，因此胰腺癌患者的死亡率依然居高不下。多种lncRNA参与了胰腺癌的化疗耐药过程。Li等[34]研究发现，体外实验中，抑制Hottip表达后，PDAC细胞生长缓慢，吉西他滨的半抑制浓度降低。利用小鼠异种PDAC模型进一步证实，与对照组相比，单独使用吉西他滨或敲除Hottip的裸鼠肿瘤生长受到抑制；联合吉西他滨治疗和敲除Hottip后，小鼠的肿瘤生长速度受到抑制更为显著。Hottip在体内外介导的吉西他滨耐药是通过正向调节HOXA13实现的。You等[35]研究发现，吉西他滨可通过调节PVT1对miR-1207的加工抑制胰腺癌细胞生长，抑制PVT1可提高吉西他滨对胰腺癌的疗效。Yang等[36]发现，在胰腺癌BxPC-3细胞中，TUG1的敲除可以促进吉西他滨的疗效，而过表达TUG1结果则相反。进一步探讨其机制，TUG1可能是通过增加磷酸化细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的表达，激活ERK信号通路进而上调某些耐药基因而实现肿瘤耐药的。此外，近年来亦有许多研究发现新的lncRNA可促进胰腺癌的吉西他滨耐药，如SLC7A11-AS1[37]、GSTM3TV2[38]、HCP5[39]、SBF2-AS1[40]、RP11-567G11.1[41]等。通过抑制以上lncRNA的表达逆转胰腺癌化疗耐药性，提高化疗的疗效，或许可为临床胰腺癌的治疗提供新的思路。

3 lncRNA与胰腺癌的临床特征及预后

胰腺癌恶性程度高，5年生存率低，预后差，准确评估患者预后、改善临床结局也是临床工作中的重要环节。探究lncRNA与胰腺癌患者预后的关系，调整预后相关lncRNA的表达水平、改善预后或可作为胰腺癌新的治疗策略。Wu等[42]研究发现，HOTAIR在胰腺癌组织中的表达异常升高，从TGCA数据库收集179例胰腺癌患者，根据HOTAIR表达水平高低分为两组，采用Kaplan-Meier法绘制的生存曲线表明，HOTAIR高表达的胰腺癌患者比HOTAIR表达相对低的患者预后更差。也有研究[43]通过相似方法，证实ABHD11-AS1高表达组胰腺癌患者的5年总生存期(overall survival，OS)时间明显短于ABHD11-AS1低表达组。进一步对ABHD11-AS1表达水平是否可作为预测胰腺癌患者预后的独立因素进行了单因素和多因素分析发现，ABHD11-AS1的高表达是预示胰腺癌患者预后不良的独立预后参数。此外，胰腺癌患者的ABHD11-AS1的表达水平与远处转移、TNM分期和肿瘤分化程度呈正相关。Ou等[44]研究发现，胰腺癌患者癌组织和血清中HULC表达明显高于相应的癌旁组织，并通过生存曲线分析血清HULC与胰腺癌病理特征的关系，发现HULC与肿瘤大小、T分期、M分期、血管侵犯有关。此外，对胰腺癌患者的3年OS进行了Cox回归分析，发现T分期、M分期、血管侵犯和血清HULC水平是影响胰腺癌患者3年OS的独立预后因素。Liu等[45]研究发现，胰腺癌患者血清UFC1水平显著高于健康对照组，并与胰腺癌的淋巴结转移、远处转移和临床分期呈正相关。同时，UFC1高表达患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)和OS均短于UFC1低表达患者。多因素分析显示，临床分期和UFC1表达水平是影响胰腺癌患者预后的显著独立因素。因此，以上lncRNA的表达可能作为胰腺癌患者预后情况的生物标志物，对上述lncRNA的评估或可预测胰腺癌患者的生存率。

4 小结与展望

随着分子生物学的发展，既往曾被认为是“转录噪音”的lncRNA逐渐被人们所认识并成为研究热点。lncRNA在肿瘤中通过不同机制发挥作用，调控肿瘤的发生发展，影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，为探索肿瘤疾病新的治疗手段和评价方法提供了分子理论基础。但由于lncRNA种类繁多，且同一种lncRNA可通过不同机制参与肿瘤疾病发展的多项环节，因此具体调控网络还不够清晰，目前对于lncRNA的认识还只是冰山一角。上述研究为进一步寻找胰腺癌的治疗靶点及解决胰腺癌的化疗耐药问题提供了新的思路，但具体能否应用及如何应用到临床中还需进行更深入的探索。此外，应用lncRNA也有望成为胰腺癌患者的早期诊断及评判预后的分子标志物，但仍需进行大样本量的研究进一步证实及检验。上述研究中大多数是从胰腺癌组织中进行lncRNA的测定，但在临床运用中组织穿刺活检常受到医疗条件及患者意愿等因素的限制。先前有研究[46]测定患者唾液中进行lncRNA水平并探讨其作为胰腺癌的早期生物学指标的价值取得了令人满意的成果，提示我们或可从患者体液，如唾液、尿液、血液等标本获取lncRNA，从而提高其临床应用的可行性。总之，探索lncRNA与胰腺癌间的关系，将其应用于胰腺癌的早期发现和治疗中，还有很长的路要走。未来应大量开展胰腺癌动物模型实验，进一步深入研究lncRNA的潜在机制，清晰lncRNA的调控网络。相信在不久的将来，lncRNA可成为胰腺癌的早期诊断、判断预后的生物标志物及新药治疗靶点，为改善胰腺癌患者的生活质量及延长胰腺癌患者的生存时间带来新的希望。