先天性大疱性鱼鳞病样红皮病一例KRT1及KRT10基因突变检测

于学萍 孙勇虎 施仲香 周桂芝 刘 红 张福仁

1滨州医学院，山东烟台，264033；2山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院，山东省皮肤病性病防治研究所)，山东济南，250022

先天性大疱性鱼鳞病样红皮病(bullous ichthyosiform erythroderma, BCIE)是一种罕见的常染色体显性遗传皮肤病，发病率1/400000～1/100000[1]，约50%有阳性家族史[2]。患者的皮肤损害多出现于出生时或出生后不久[2],通常临床表现为出生时即有水疱、鳞屑及红皮症，以后发展为广泛的角化过度，主要累及四肢屈侧皮肤，呈灰棕色厚积鳞屑[3]。先前研究表明BCIE是由角蛋白1或10基因(Keratin, KRT)突变引起[1],突变频率约50%[4]。本研究报道BCIE散发病例1例，通过PCR扩增和Sanger直接测序法对KRT1及KRT10基因进行突变检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象 我院皮肤科门诊经临床及组织病理确诊的1例BCIE患者。先证者，女，6岁。自幼双下肢皮肤增厚、皲裂、干燥，后波及全身皮肤，以双下肢为甚，自觉皮肤紧绷干燥，冬重夏轻，皮损渐重，融合成片(图1)。皮肤科情况：皮肤干燥，躯干、四肢可见褐色黏着性斑片，皮疹边界不清。组织病理示：基底层以上棘层松解、细胞破坏、空泡变性，表皮内裂隙形成颗粒层细胞变性“有大而深染嗜碱颗粒”，角质层增厚(图2a)，DIF显示：表皮细胞间及基底膜IgG、C3、IgM、IgA阴性(图2b)。根据患者的临床表现及病理结果，诊断为先天性大疱性鱼鳞病样红皮病。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究经山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会批准，签署知情同意书后，抽取患者及其家属外周血5 mL，同时采集100名无亲缘关系的正常个体外周血5 mL作为对照，-80℃保存。采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA，并用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(Thermo Fisher公司，美国)测定其纯度及含量，将其标化为30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 根据既往报道的文献设计特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增KRT1及KRT10基因全部外显子及侧翼序列[3]，引物交由北京华大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反应体系为:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反应条件：预变性94℃ 10 min，变性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s，延伸72℃ 10 min，共进行 35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 DNA 测序 PCR产物经醋酸钠-乙醇沉淀法纯化后直接于ABI 3130XL基因分析仪(Applied Bio-systems，美国)上进行测序。

1.2.4 突变分析 所有测序结果经NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库进行分析比对，用SIFT及Polyphen-2软件对基因突变进行功能预测。

2 结果

除KRT10基因7号外显子无法扩增出目的条带外，患者KRT1、KRT10基因的其他外显子经PCR后直接测序，KRT1未检测到突变，KRT10的1号外显子第467位存在一杂合点突变，使CGC→CAC,导致KRT10基因所编码的蛋白第156位氨基酸酸由精氨酸(R)变为组氨酸(H)，即P.R156H，结果均经反向测序证实。而家系中非患者及100名正常对照均无此点突变(图3)。

3a：先证者；3b：先证者母亲；3c：先证者父亲

利用SIFT及Polyphen-2 (http：//genetics.bwh.harvard.edu)对非同义突变对蛋白质的影响进行分析，以上软件预测表明突变p.R156H对蛋白质结构影响均为“damaging”。

检索 Pubmed 和万方数据库至今发表的有关本病KRT1及KRT10基因突变的文章，其中在2000年报道了一个日本家系中BCIE患者，与本研究中的患者携带相同突变基因[5]。分别于2002年[6]和2011[7]年在两例中国患者中均发现第156位氨基酸的突变，由于第467位碱基发生G→A杂合突变(c.467G>A) ，而使精氨酸变为组氨酸(p.R156H)。

3 讨论

BCIE是角蛋白相关遗传性皮肤病的一种，连锁分析已证实为角蛋白K1或K10基因突变所致，Mayuzumi等[5]报道的该突变都发生于白种人，对于亚洲人群中这些基因突变的发生率还知之甚少。K1和K10在分化层的角质形成细胞内配对表达，构成角质形成细胞的骨架[1]，它们的正常表达对保护机体抵御外界刺激，维持细胞正常结构及细胞间的黏着起重要作用[2]。K1和K10的突变可以引起角蛋白中间丝的结构、排列或聚集异常，引起角化过度、细胞内水肿，从而导致BCIE[8]。另外，K1和K10蛋白还可以抑制细胞增殖，因此，BCIE后期的主要表现为角化过度，可能是由于缺乏抑制作用[9]。K1和K10分为螺旋杆状区、非螺旋的头区和尾区及连接区，杆区又分为1A、1B、2A、2B四个功能区，其间由L1、L12、L2三个非螺旋区链接，在1A起始区(HIP)及2B结尾区(HTP)有两个高度保守的区域,均由20个氨基酸组成[9]，目前公认的致病突变的“热点”区域包括：1A中的H1和HIP，L2和HTP。另外，根据突变位置的不同，临床表现及皮损轻重程度均有较大差别[2]。

本文报道患者其临床表现及组织病理均符合BCIE的诊断。对K1/K10基因进行Sanger测序发现，KRT10的1号外显子存在错义突变，即c.467G>A(p.R156H)。患者父母及正常对照者无此替代，说明是突变而不是单核苷酸多态性[2]。患者无家族史，说明可能为家族中的新发病例。

K10第156位氨基酸(即1A起始区的第10个残基)的突变是该基因热点突变中的热点。此位点上的突变已在多个种族的BCIE患者中被发现,此位点对于角蛋白中间丝结构的稳定至关重要[3,10]。Haruna等[11]分析总结了31例因K10第156位氨基酸突变引起的BCIE患者的临床表型,其中23例患者表现为严重的临床表型，另外6例表现为轻度的临床症状。因此K10基因中第156(R156)位精氨酸残基是高度保守的，其错义突变可引起多数患者较严重的临床表型[9,12]。此位点的精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸的替代也均有报道。孙秀坤等[3]对国内两例BCIE患者的研究中，发现两例患者均在K10 156位氨基酸上发生突变，其中突变型为R156P的患者临床表现严重，而突变型为R156H的患者仅有轻微的临床症状。因此即使突变发生在同一位点，但替代的氨基酸不同，所致的临床表现也不同。两个氨基酸功能相差越大，经替代后的蛋白结构也就相差越大，疾病表型也越严重。先前文献报道，K10基因突变所致的BCIE患者一般不累及掌跖部位，本例患者也符合此特征。而K1在掌跖部位的角质形成细胞中有表达，因此累及掌跖部位的BCIE患者多是由K1基因突变所导致的[2]。

该病目前无特效药物治疗，主要给予长期口服阿维A及外用润肤剂、维A酸、角化剂和维生素D的类似物等治疗[13,14]。对受影响个体的父母和具有相似背景的病例可以接受必要的基因检测和遗传咨询。本研究为基因诊断和基因治疗提供了实验基础和诊断依据，并为进一步研究KRT10基因突变与BCIE的关系提供了依据。