食品中硒的含量检测及形态分析

黄韬睿，王小平，王鑫*

1. 四川旅游学院烹饪学院（成都 610100）；2. 四川省食品药品检验检测院（成都 610097）

硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等显著生理功能，所以维持机体中适量的硒水平能预防多种疾病，如癌症、克山病、大骨节病等[1]。然而，从世界卫生组织公布的数据来看，全球普遍存在缺硒的问题，40多个国家和地区处于低硒或缺硒的状态[2]。通过食物补硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法[3]。国际学术组织联合会（FAO/WHO/IAEA）建议成年男女膳食硒适宜需要量分别为40和30 μg/d[4]。长期食用含硒低于0.1 mg/kg的食物会导致人体硒缺乏反应症，长期食用硒高于1 mg/kg的食物则会引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形态主要分为无机硒和有机硒，无机硒主要包括单质硒、硒酸盐、亚硒酸盐，挥发态的甲基硒和硒化氢有较大毒性[6]。有机硒主要为大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物。有机硒毒性远低于无机硒，生物活性更高，富含营养，更有利于人体吸收[7]。

目前绝大多数食品标准对于食品中硒的营养和毒性分析是远远不够的。建立快速、灵敏、准确的方法检测食品、药品及保健品等产品中的硒含量以及对硒化学形态进行分析对人类的健康和经济发展有着重要意义[8]。而要实现食品中不同硒元素形态的分析，首先必须建立食品中硒化物的提取、分离和检测方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法[9]、酸提取法[10]、酶提取法[11]、固相萃取法[12]等，也有使用氢氧化钠[13]、Tris-盐酸缓冲液[14]等作为提取剂的。硒化物分离检测的主流方法包括液相色谱与原子荧光联用（HPLC-AFS）法[15]、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）法[16]、液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（HPLC-ICP-MS）法[17]、气相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（GC-ICP-MS）法[18]和电泳及其联用技术[19]等。此次试验在运用ICP-MS技术测定食品中总硒含量的基础上再利用酶解技术提取富硒食品中的硒化物，并通过阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用技术实现对富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亚硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5种主要形态的硒化物的分离和检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂与材料

硒元素标准品、硒酸根（SeO42-）溶液、亚硒酸根（SeO32-）溶液、硒代胱氨酸SeCys2（98%）、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys（98%）、硒代蛋氨酸SeMet（98%），美国Sigma公司；胃蛋白酶，美国Sigma公司；柠檬酸（色谱纯）、硝酸（色谱纯）、氨（色谱纯），美国Sigma公司；富硒食品样品，市售。

1.1.2 仪器与设备

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔；SNO2355R iCAP RQ ICP-MS电感耦合等离子质谱，美国赛默飞世尔；Hamilton PRP X-100阴离子交换柱，美国安捷伦；7DFE8C7A恒温振荡器，上海智成分析仪器制造有限公司；3K30离心机，美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 食品中硒元素含量检测方法的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》中规定的食品中硒元素含量检测方法，利用微波消解对样品进行前处理并使用ICP-MS技术检测食品中硒元素含量，选用多种标注硒元素含量富硒食品对检测方法进行验证。ICP-MS方法测定硒元素存在一些难点，主要在基体效应和干扰方面。Se元素属于难电离元素，电离能力受到基质中有机物和酸量的影响，有机物对硒元素有增敏作用，而酸则有抑制效应，因此要尽量保证标准溶液和样品中有机物含量及酸度一致，可以在内标溶液中加入适量异丙醇匹配有机物。Se元素测试容易受到ArAr多原子离子干扰，采用iCAP RQ ICPMS时推荐选用78Se在KED模式下进行测试，KED模式可有效去除多原子离子干扰，降低背景提高检出水平。

1.2.2 实际样品硒含量的检测

将市售富硒食品（标注含量）作为检测样品进行硒含量检测，验证方法准确度。

1.2.3 硒化合物的提取

此次试验模拟胃液消化过程对富硒产品中硒化物进行提取。分别称取0.1 g研磨成细粉状样品于离心管中，加入10 mL 0.1%盐酸，超声振荡30 min，加入30 mg胃蛋白酶在37 ℃条件下恒温振荡24 h，然后经离心、过滤、稀释5倍后进行形态分离检测。

1.2.4 5种硒化物混合标准溶液的制备

将5种不同形态硒化物的标准溶液用去离子水配制成质量浓度为空白，1，5，10，50和100 μg/L的标准溶液，用于制作标准曲线。

1.2.5 色谱条件及仪器参数

具体色谱条件及仪器参数见表1和表2。

表1 5种硒化物分离色谱条件

表2 检测仪器参数

1.2.6 标准曲线的制定

将1.2.4制备的5种硒化物同浓度标准溶液分别混合，按照1.2.5色谱条件及仪器参数进行分离检测，记录5种硒化物不同浓度下的峰面积积分并分别制定标准曲线。

1.2.7 实际样品硒元素含量的检测和5种不同硒化物形态的分离检测

选取市售富硒苦瓜雪莲精华片、富硒青钱柳蛹虫草片和硒黄酮三种样品进行硒元素含量检测和5种不同硒化物形态的分离检测，并对结果进行分析。

1.2.8 方法检出限测定

以5种硒化物质量浓度均为0.5 μg/L混合标准溶液进样，测得5种硒化物响应强度与基线噪音强度，推算方法检出限。

1.2.9 方法回收率测定

为了考察方法准确度，向富硒青钱柳蛹虫草片提取液中加入5种硒形态质量浓度同为38 μg/L的混合标准溶液，进行3次水平试验，分别计算5种硒化物的平均回收率。

2 结果与分析

2.1 硒元素标准曲线的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》中规定的食品中硒元素含量检测方法，将硒元素标准品配制成质量浓度分别为1，5，10，50和100 μg/L的溶液，按照1.2.1方法进行检测，记录峰面积制作标准曲线。标准曲线方程为y=2 626.595x+126.650，R2=1.000，硒元素在0～100 μg/L浓度范围内线性相关系数均为1.000，线性关系良好。

2.2 实际样品硒含量的检测

将市售富硒食品（标注含量）作为检测样品进行硒含量检测，验证方法准确度，结果见表3。结果表明，该方法检测富硒食品中硒元素含量的回收率均在90%以上，方法准确度高。

表3 实际样品硒元素含量检测结果

2.3 5种硒形态各浓度混合标准溶液色谱图的制备

将5种不同硒形态标准液混合物按照1.2.5色谱条件及仪器参数进行分离检测，得到各浓度的色谱图并将5种不同浓度标准混合液所得色谱图进行叠加，结果见图1和图2。所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100阴离子交换柱，以5 mmol/L柠檬酸、氨水调节pH 4.7为流动相，等度洗脱，对于5种硒元素形态分离效果较好，在900 s内可完成5种硒形态的快速分离。

图1 0.1 μ g/L混合标准溶液色谱图

图2 5种硒形态各浓度混合标准溶液色谱叠加图

2.4 5种硒形态混合标准溶液的标准曲线

按照1.2.6制定5种不同硒化物的标准曲线，5种硒化物在0～100 μg/L质量浓度范围内线性相关系数均为1.000，线性关系良好（表4）。

表4 5种硒形态标准曲线参数

2.5 实际样品检测结果

按照1.2.7方法，分别对市售富硒苦瓜雪莲精华片、富硒青钱柳蛹虫草片和硒黄酮3种样品进行编号（1，2和3号样品），并对其进行硒元素含量检测和5种不同硒化物形态的分离检测，结果见图3～图5和表5。结果表明，该检测方法和条件能有效分离检测实际富硒食品中5种不同形态硒元素。从结果中也可以看到3种富硒样本中硒种类与含量各不相同，其营养价值和利用度值得深入探究。但从回收率结果来看，此次试验采用单一胃蛋白酶在0.1%盐酸体系下酶解提取样品中硒元素，提取效率不高，考虑到实际样品的复杂性，需进一步优化前处理步骤，可对样品中基质进行预分离或利用复合酶解等方式提高提取效率。

图3 1号样品色谱图

图4 2号样品色谱图

图5 3号样品色谱图

表5 实际样品检测结果

2.6 5种硒化物方法检出限测定结果

按照1.2.8方法测得各形态峰高均大于等于基线噪音的3倍的检出限。SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet检出限可分别达到0.25，0.20，0.25，0.50和0.30 μg/L。由1.2.3可知，样品取样量和定容体积分别为0.1 g和50 mL，计算可得SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet方法检出限分别为0.125，0.1，0.125，0.25和0.15 mg/kg。

2.7 方法回收率测定结果

为了考察方法准确度，向富硒青钱柳蛹虫草片提取液中加入5种硒形态质量浓度同为38 μg/L的混合标准溶液，进行3次平行试验，分别计算5种硒化物的回收率，结果见表6。该方法分离检测食品中5种不同形态硒的加样回收率均在90%以上，结果表明，利用阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用技术能有效分离检测富硒食品中5种不同硒元素形态并实现5种形态硒元素的定量检测，检测结果准确率高。

表6 加样回收率测定结果 单位：%

3 结论

此次试验建立了利用阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子色谱联用分离检测富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亚硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5种不同硒元素形态的方法，其中采用胃蛋白酶在0.1%盐酸体系下酶解提取食品中的硒化合物。结果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100阴离子交换柱，以5 mmol/L柠檬酸，氨水调节pH 4.7为流动相，等度洗脱，对于5种硒元素形态分离效果较好，在900 s内可完成5种硒形态的快速准确分析，是一种有效可行的对富硒产品中硒形态的分析方法。从结果中也可以看到3种富硒食品样本中硒种类与含量各不相同，其营养价值和利用度值得深入探究。另外，此次试验采用单一胃蛋白酶在0.1%盐酸体系下酶解提取样品中硒元素，提取效率不高，考虑到实际样品的复杂性，需进一步优化前处理步骤，可对样品中基质进行预分离或利用复合酶解等方式提高提取效率。