超声辅助有机溶剂法提取葡萄皮原花青素工艺条件

张玉清 ，毕可海 ，张玉莹 ，李银塔 ，王世苹

1. 威海市特色果蔬高值加工工程技术研究中心（威海 264300）；2. 威海海洋职业学院食品工程系（威海 264300）

原花青素是存在于植物中酚类化合物的总称[1]，有较强的抗氧化和清除自由基的能力[2]，其抗氧化和清除自由基的能力是维生素C的20倍。同时，因其安全无毒，被称为目前最安全、最高效的天然抗氧化剂[3-6]。原花青素还具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗衰老、护肝解毒、防治糖尿病等功效，因此具有较高的食用、药用价值，还可应用于化妆品行业[7-11]。

原花青素在葡萄及松树树皮中含量较高[12-14]。葡萄是最常见的水果之一，美味可口、营养丰富，富含多种矿物质及维生素[15]。葡萄的加工制品很多，如葡萄干、葡萄汁、红酒等[16-19]，但是大部分都属于初加工产物，而对于更深层次的，如原花青素的开发利用研究相对较少。

对葡萄中原花青素的提取研究主要集中在葡萄籽[20-23]，而从葡萄皮中提取原花青素的研究相对较少，且提取方法较为单一，主要有酶法提取[24]、有机溶剂提取法[10]等，提取效率较低。试验以有机溶剂法提取葡萄皮中的原花青素为基础，以超声辅助提取，并利用响应面优化提取条件，以提高原花青素提取量，并且反应较为安全、高效，为拓展原花青素的提取条件研究、提高资源开发利用价值提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄（市售，山东荣成）；原花青素（上海阿拉丁生化科技）；乙醇、丙酮、甲醇、香草醛、硫酸等（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（普析通用）；电子天平（奥豪斯仪器（上海））；KQ-500DE超声（昆山市超声波仪器）；XW-80A旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器）。

1.3 试验内容

1.3.1 葡萄皮预处理

挑选好的葡萄除去枝干，清洗后剥皮、去肉、去籽，将葡萄皮置于烘箱中烘干，然后粉碎、过筛，制成葡萄皮粉末，避光保存备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

取原花青素标品10 mg，用甲醇配制成1.0 mg/mL标准储备液，分别稀释成质量浓度为0.025，0.050，0.100，0.200，0.250和0.500 mg/mL的标准系列工作液，分别取1 mL加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液和2.5mL 30%硫酸-甲醇溶液，摇匀，30 ℃水浴保温20 min。在546 nm的波长下测其吸光度，绘制标准曲线。

1.3.3 不同溶剂对葡萄皮中原花青素提取量的影响

准确称取1.0 g葡萄皮粉末于锥形瓶中，分别向锥形瓶中加入体积分数均为50%甲醇、乙醇、丙酮溶液20 mL，将锥形瓶置于温度60 ℃水浴锅中水浴60min，经过滤后提取2次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。取1 mL加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，摇匀，30 ℃水浴保温20 min。在546 nm波长下测其吸光度。

1.3.4 溶剂体积分数对葡萄皮中原花青素提取量的影响

按1.3.3所述方法，向锥形瓶中加入体积分数分别为30%，40%，50%，60%和70%乙醇溶液20 mL，探讨乙醇溶液的体积分数对原花青素提取量的影响。

1.3.5 不同温度对葡萄皮中原花青素提取量的影响

按1.3.3所述方法，将锥形瓶置于温度分别为30，40，50，60，70和80 ℃的水浴锅中水浴60 min，研究提取温度对葡萄皮中原花青素提取量的影响。

1.3.6 不同提取时间对葡萄皮中原花青素提取量的影响

按1.3.3所述方法，将锥形瓶置于温度50 ℃水浴锅中分别水浴20，30，40，50，60和70 min，探讨提取时间对原花青素提取量的影响。

1.3.7 料液比对葡萄皮中原花青素提取量的影响

准确称取1.0 g葡萄皮粉末于锥形瓶中，按料液比分别为 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40（g/mL），向锥形瓶中加入体积分数60%乙醇溶液，按1.3.3所述方法，研究料液比对原花青素提取量的影响。

1.3.8 提取次数对葡萄皮中原花青素提取量的影响

准确称取葡萄皮粉末于锥形瓶中，向锥形瓶中加入体积分数60%乙醇溶液，将锥形瓶置于温度50 ℃水浴锅中分别水浴40 min，过滤，分别提取1，2，3和4次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。按1.3.3所述方法，研究次数对原花青素提取量的影响。

1.3.9 超声辅助对葡萄皮中原花青素提取量的影响

准确称取葡萄皮粉末于锥形瓶中，向锥形瓶中加入体积分数60%乙醇溶液，将锥形瓶置于35 kHz超声中辅助提取，温度50 ℃超声40 min，取出，过滤，提取3次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。按1.3.3所述方法，探讨超声辅助提取对原花青素提取量的影响。

1.3.10 响应面优化

由单因素可知，料液比、提取时间、提取温度3个因素对原花青素的提取影响显著，因此利用Central Composite Design（CCD）进行响应面分析探究各因素影响原花青素提取的规律，同时分析各因素间的关系，设计三因素三水平试验，以料液比（g/mL）、提取时间（min）、提取温度（℃）3个因素为研究对象，试验设计见表1。经响应面分析后得到原花青素的最大提取量和最优提取条件，并进行验证。

表1 响应面试验设计

1.3.11 原花青素提取量的测定

原花青素提取量按式（1）计算[23]。

式中：V为试剂定容体积，mL；C为试剂中原花青素质量浓度，mg/mL；n为稀释倍数；W为试剂质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以原花青素质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。原花青素质量浓度在0.025～0.5 mg/mL内线性良好，线性方程为y=1.518 3x+0.002 8，相关系数为R2=0.998 9。

图1 标准曲线

2.2 溶剂对葡萄皮中原花青素提取量的影响

原花青素能溶解于极性较强的溶剂中，因此选用50%甲醇、乙醇、丙酮溶液3种溶剂作为提取溶剂。由图2可知，提取溶剂显著影响原花青素提取量。其中，原花青素在乙醇溶剂中的提取量明显高于另外2种溶剂，这可能是因为乙醇的溶解性较甲醇、丙酮要高，穿透细胞的能力强，具有较强的破壁效果，因而会有更多的原花青素溶出。因此，选用乙醇作为原花青素提取溶剂。这与郑燕升等[25]的结果相似。

图2 不同溶剂对原花青素提取量的影响

2.3 乙醇体积分数对葡萄皮中原花青素提取量的影响

乙醇体积分数显著影响着原花青素提取。在一定范围内，随着溶剂体积分数增加，原花青素提取量也随之增大。溶剂溶度60%时，提取量达到最大，可达24.73 mg/g；继续增大溶剂体积分数，提取量反而降低。这可能是因为葡萄皮粉末中含有的醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出，而这些成分也与乙醇-水分子结合，起到拮抗作用，因而原花青素的提取率下降[26]。因此，选择最适乙醇体积分数60%。

图3 不同乙醇体积分数对原花青素提取量的影响

2.4 提取温度对葡萄皮中原花青素提取量的影响

提取温度影响着原花青素的提取量。温度低于50℃时，原花青素提取量随着温度升高而增大；50 ℃时达到最大；继续升高温度，原花青素提取量反而逐渐降低。这可能是因为在一定范围内，温度升高，可以促进原花青素从细胞中溶出，而过高温度可能会导致原花青素聚合，降低原花青素提取量，因此，选择最佳提取温度50 ℃。

图4 不同温度对原花青素提取量的影响

2.5 提取时间对葡萄皮中原花青素提取量的影响

由图5可知，原花青素提取量受提取时间影响。在一定范围内，延长时间可以提高提取量。提取时间40 min时，提取量最大，为31.06 mg/g；而超过40 min后，原花青素提取量随着时间延长而降低。这可能是因为随着时间延长，原花青素与空气中的氧气接触而被氧化，降低原花青素提取量，因此，选择最佳提取时间40 min。

图5 提取时间对原花青素提取量的影响

2.6 料液比对葡萄皮中原花青素提取量的影响

料液比显著影响着原花青素提取量。由图6可知，在一定范围内，料液比增大，提取量也随之增大，料液比1∶25（g/mL）时提取量达到最大，继续增大料液比，原花青素提取量逐渐降低，这可能是因为有机溶剂可使原花青素与蛋白质、多糖结合的氢键断裂[27]，提高原花青素提取量，而过多有机溶剂可能会影响原花青素后期的纯化不利，因此，选择最适料液比1∶25（g/mL）。

图6 料液比对原花青素提取量的影响

2.7 提取次数对葡萄皮中原花青素提取量的影响

由图7可知，重复提取，可以增大原花青素提取量，提取2次时葡萄皮中大部分花青素已被提取出，提取3次时原花青素基本提取完全，提取次数超过3次后，提取量增加幅度极小，为避免造成浪费，选择最佳提取次数3次。

图7 提取次数对原花青素提取量的影响

2.8 超声辅助对葡萄皮中原花青素提取量的影响

由图8可知，超声辅助可以提高原花青素提取量，相较于未使用超声辅助提取量可提高11.73%，这可能是因为，超声辅助可使葡萄皮细胞的裂解更充分，原花青素的溶出更充分，从而增大提取量。这与张晓娟等[1]结果相似。

图8 超声辅助对原花青素提取量的影响

2.9 响应面分析

2.9.1 模型的建立与显著性检验

经单因素试验发现，原花青素提取量受提取温度、提取时间及料液比的影响较大，为探究3个因素对原花青素提取规律，以响应面试验分析，通过数据处理，建立响应值（提取量）与3个因素间的回归模型，得到的回归方程：Y=38.13+4.83A+1.48B+0.67C-1.05AB+0.49AC-0.49BC-4.38A2-0.93B2-1.44C2（其中，Y，原花青素提取量；A，提取温度；B，提取时间；C，料液比）。

表2 三因素三水平RSM试验及原花青素提取量

通过响应面分析，结果见表3。模型的p＜0.000 1，显著，而失拟值p＞0.05，不显著，表明模型有着较高的可靠性，同时模型上的数据被充分拟合；原花青素提取量的变异系数CV=0.47，回归方程的相关系数R2=0.996 3，说明预测结果可靠，模型相关度较好，误差小；并说明方程能较好地描述响应值与各因素间关系，可用于预测实际的试验结果。

2.9.2 响应面的交互作用分析

通过响应面曲线图可以分析出提取温度、时间、料液比3因素对原花青素提取量的影响，可以直观地观察各因素间的交互作用以及确定原花青素最大提取量和最适提取条件。

表3 RSM变量方差分析

图9可以反映出在提取温度一定条件下，提取时间和料液比均会显著影响原花青素的提取，在一定范围内，原花青素提取量随着提取时间的延长及料液比增大而增大，并且两者交互作用显著影响提取量。在提取时间一定条件下，提取温度和料液比对原花青素的提取影响较大，从等高线图可知，提取温度对原花青素的提取影响更大。在料液比一定条件下，提取温度、时间显著影响原花青素的提取，随着温度升高和时间延长，提取量逐渐增大，并且两者交互影响显著。

在影响原花青素提取量的因素中，提取温度对原花青素提取量的影响最为显著，提取时间次之。

2.9.3 回归模型验证

图9 原花青素提取量的响应面图

通过模型分析及原花青素最优提取条件的预测，得出在提取温度55 ℃、提取时间44 min、料液比1∶26（g/mL）时，原花青素提取量预测值为39.78 mg/g。对最优提取条件进行验证（见表4），选择提取温度55 ℃、提取时间44 min、料液比1∶26（g/mL）、平行3次。结果表明，验证值与模型的预测值的误差相对较小，说明该模型可对提取量进行分析预测。

表4 验证试验结果

3 结论

试验以超声辅助有机溶剂提取法提取葡萄皮中原花青素，通过优化不同提取条件，如不同提取溶剂、溶剂体积分数、提取温度、提取时间、料液比等条件。初步确定葡萄皮中原花青素的提取条件：提取溶剂采用60%乙醇，温度50 ℃，提取时间40 min，料液比1∶25（g/mL），在超声辅助下提取3次，原花青素提取量可达38.47 mg/g。通过响应面优化分析，在提取温度55 ℃、提取时间44 min、料液比1∶26（g/mL）条件下，原花青素提取量可达39.42 mg/g。结果表明葡萄皮中富含原花青素，通过超声辅助有机溶剂提取，可有效提取原花青素，且提取过程安全、无毒。试验结果为原花青素的提取及应用提供基础。