异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠子宫内膜异位症炎症反应的调节作用

李晓宇，朱保伟，赵 明，张淑敏

(1.烟台赛泽生物技术有限公司，山东 烟台 264000；2.山东国际生物科技园发展有限公司，山东 烟台 264000；3.滨州医学院，山东 烟台 264033)

0 前言

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)又称内异症，是指在子宫以外的其他位置生长了内膜组织，由于患者病灶部位经常性出血，最终导致疾病进程[1]。育龄期女性的患病率约为10%～15%[2]。当前，EMs的发生被广泛认可的是经血逆流学说，但其仍无法合理地解释非盆腔内异位病灶的形成原因。虽然EMs已成为一个备受关注的问题，但临床上仍缺乏明确的诊断标志物和比较有效的治疗手段[3]。现已证实，腹腔的微环境中如果长期存在炎症，有可能会引发局部免疫抑制，造成EMs的发展，这为通过消炎或调节局部免疫治疗EMs提供了理论支撑。近年来，干细胞的研究为疾病治疗提供了新思路。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有高度自我更新和潜在多向分化能力的多能干细胞，参与慢性损伤修复以及损伤组织重建，同时可以调控巨噬细胞亚型转化，参与机体促炎与抗炎双重效应。在体外分离获得大鼠BMSCs，将其注射于内异症模型鼠中，探讨其对异位症模型炎症的调节作用，以期为内异症的研究和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料

主要材料：HE染色试剂盒(中国格凡生物公司生产)，ELISA检测试剂盒(美国Bethyl公司生产)，流式抗体(美国BD公司生产)。

主要仪器：流式细胞仪(美国BD公司生产)，冷冻切片机(德国leica公司生产)，荧光倒置显微镜(日本尼康公司生产)。

实验动物：SD雌性大鼠(200 g左右)30只。

1.2 大鼠BMSCs的分离与鉴定

贴壁法分离BMSCs。随机选取5只大鼠，处死大鼠，酒精消毒，无菌下剪开皮肤后取双侧股骨，用含双抗的PBS中冲洗3～5次，剪掉两端骨骺，用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔，吹匀重悬，过200目筛网，1 500 rpm离心3 min。用完全培养基重悬，按照细胞密度2*106个/mL铺瓶，置于细胞培养箱中48 h后，弃培养液去除未贴壁细胞，以后每隔2～3 d换液。细胞汇合至70%～80%时，1∶1传代扩增培养。

细胞表型鉴定。细胞传至第3代，胰酶消化后取2*106个细胞，离心弃上清，PBS洗2遍，重悬于流式管中，加入相应抗体和同型对照，避光孵育30 min，离心弃上清，PBS洗2遍，重悬混匀后上机检测。

1.3 大鼠内异症模型的建立

建模前2～3 d，饲喂戊酸雌二醇片。参考Vemond 等的建模方法，自体移植建立内异症模型。术后第二天戊酸雌二醇饲喂，3 d一次，连续4次。建模鼠4周后剖腹观察25只异位组织生长状况，选取建模成功且活力良好的大鼠12只并随机分成2组。假手术组(5只)的手术方法同建模组，开腹后结扎一侧子宫角，其他相同。与建模组动物置于同样环境下分笼饲养。

1.4 实验分组及给药

造模成功并分组后，BMSCs组取对数期细胞，用生理盐水制成密度为2*106/mL的细胞悬液，经尾静脉缓慢注入0.5 mL ，对照组注射等量生理盐水。细胞移植4周后处死大鼠，并取下异位囊肿行HE染色。

1.5 血液、腹腔液和组织的取材及检测

腹腔巨噬细胞的提取及流式检测：处死大鼠并消毒，腹腔注射30 mL PBS，轻揉数分钟。吸出灌洗液，300 g离心弃上清，加入2 mL红细胞裂解液，300 g离心，用DMEM培养液重悬，接种于瓶，置于培养箱。4 h后轻轻弃掉培养基，洗去未贴壁细胞，然后收集贴壁细胞，PBS洗涤2次，重悬于流式管中，加入对应抗体，避光孵育30 min后上机检测。

实验结束时，先抽取100 uL腹腔液。开腹后，腹主动脉取5 mL血，离心后取上清液。按试剂盒说明书要求检测 IL-2、TNF -α蛋白浓度。

小心取下各组异位囊肿，假手术组取正常子宫内膜组织，行HE染色。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠BMSC的形态特征及鉴定

镜下观察，原代细胞贴壁生长，为不规则多边形，增殖速度较慢。传代培养后第3代，细胞形态趋于均一纺锤形，后期呈旋涡状生长(见图1)。

图1 大鼠BMSCs形态(5×10)Fig.1 Rat BMSMs morphology(5×10)

流式分析结果显示，大鼠 BMSC 检测细胞表面分子HLA-DR、CD14、CD19、CD90的阳性率分别为 0.8%、98.7%、0.2%、0.8% (见图2)，结果符合国际细胞治疗MSC标准中的规定。

注：A：HLA-DR B：CD14 C：CD19 D：CD90图2 大鼠BMSCs细胞表型鉴定Fig.2 Rat BMSCs cell phenotype identification

2.2 大鼠内异症模型的建立

选25只雌性SD大鼠，随机5只为假手术组，其余20只用于建模。建模4周后，15只大鼠皮下可见明显凸起。麻醉大鼠，无菌下开腹，查看模型建立情况。在筋膜层与肌肉层形成囊泡状结构，内充满液体，表层有新生血管，说明建模成功(见图3.D)。20只大鼠有3只死亡(2只因过度麻醉死亡，1只感染致死)，2只未成模，15只建模成功，移植成活率为75%。

注：A：结扎一侧子宫 B：纵剖子宫 C：子宫内膜缝合于腹腔壁 D：四周后开腹图3 大鼠内异症模型的建立Fig.3 Modeling construction of rat endometriosis

2.3 大鼠血液及腹腔液中的VEGF和TNF-α的表达差异

与假手术组相比，对照组的血清和腹腔液中VEGF、TNF-α的水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。移植BMSCs后，与对照组相比，VEGF水平升高，TNF-α的水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.4 腹腔液巨噬细胞表型的变化

BMSCs组M1型巨噬细胞(CD86+)亚群比例低于对照组，而M2型巨噬细胞(CD206+)亚群比例明显高于对照组。

2.5 病理组织学比较

假手术组腺体结构较多，腺上皮细胞呈柱状(见图5.A)。与假手术组相比，对照组腺体数量减少并伴有纤维化，上皮细胞锯齿状生长，结缔组织较多(见图5.B)。BMSCs组腺体缩小，与对照组相比，腺体和血管明显减少，上皮层较薄，间质细胞较少(见图5.C)。

表1 血清和腹腔液中VEGF和TNF-α的含量Tab.1 VEGF and TNF-α content of serum and peritoneal fluid

注：A：假手术组 B：对照组 C：BMSC治疗组 注：*表示与假手术组比较，P<0.05；#表示与对照组比较，P<0.05。图4 腹腔液巨噬细胞表型比较Fig.4 Comparison of peritoneal fluid macrophage cell phenotype

注：A：假手术组 B：模型对照组 C：模型BMSC给药组图5 各组大鼠子宫内膜的病理学组织比较Fig.5 Comparison of endometrial pathology organization of rats in two groups

3 讨论

子宫内膜异位症虽不是肿瘤性疾病，但表现类似与恶性肿瘤，且易于复发和进展，5年的累积复发率约为40%～50%。有研究证实，腹腔微环境中慢性炎症的长期存在可引发免疫抑制，导致内异症进展，因此消炎或免疫调节也成为治疗本病的新方向。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是能够引起局部或全身炎症反应的因子之一，而M2型巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、精氨酸酶-1(Arg-1)和IL-10等在抑制炎症方面起到重要作用，这些因子表达水平与内异症局部微环境的炎症反应的消除密不可分。曹佃贵等通过检测腹腔液中VEGF、TNF-α 含量发现，内异症与正常群体中VEGF、TNF-α 含量有很大差异，可作为内异症的诊断及治疗突破点。TNF-α是由M1型巨噬细胞分泌，参与体内急性促炎反应，用以清除病原体和病变细胞。M1型巨噬细胞主要介导炎症反应和免疫防御功能，同时会引起组织损伤。而M2型巨噬细胞可以参与碎片清除、组织修复等，其表现出很强的抗炎活性，在修复炎症造成的组织损伤以及重建局部组织稳态方面起到重要作用。间充质干细胞分泌多种具有调节免疫和抗炎作用的细胞因子，可用于治疗免疫调节失衡导致的炎症和免疫性相关的其他类疾病。有研究发现，MSCs可以诱导未极化的巨噬细胞或M1型巨噬细胞向M2型极化。

采用骨髓贴壁法成功分离得到高纯度的大鼠BMSCs，同时采用自体移植法4周后成功建立了大鼠内异症模型，移植成活率为75%，结果与文献报道一致。对照组大鼠血清和腹腔液中VEGF 及TNF-α 水平较假手术组升高，这与已报道的研究一致。BMSCs移植后，异位病灶缩小，上皮细胞变薄，间质细胞和腺体减少，说明BMSCs移植后减缓了病灶进程。巨噬细胞表型显示，BMSCs组巨噬细胞较对照组高表达M2表型的表面分子CD206，说明BMSCs移植促巨噬细胞M2型极化，进而通过影响异位症模型大鼠腹腔液中炎性分子VEGF及TNF-α的分泌，达到缓解或消除异位病灶中的炎症反应。从巨噬细胞极化和炎症因子影响的角度对移植异体BMSCs改善EMs的局部微环境及可能的机制进行探讨，结果显示，移植BMSCs促进巨噬细胞M2型极化，通过影响VEGF、TNF-α分泌水平来抑制异位病灶微环境的炎症反应，可以抑制异位症炎症进展，促进局部组织修复。