希特林蛋白缺乏症实时荧光PCR解链曲线快速基因分型的建立与应用*

刘海平，秦佳纯，袁伟曦，黄伟伦，周万军

(1.佛山市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心，广东佛山528000；2.南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室，广州 510515)

希特林蛋白缺乏症(Citrin deficiency)是SLC25A13基因突变引起肝细胞线粒体希特林蛋白(Citrin)功能不足，机体代谢紊乱的常染色体隐性遗传病，主要表现为新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD，OMIM#605814)和成年发作瓜氨酸血症Ⅱ型(CTLN2，OMIM#603471)2种年龄依赖性表型[1-5]。在目前的临床实践中，具有胆汁淤积性黄疸及相应生化指标异常，或新生儿血样瓜氨酸水平升高的可疑患儿，通过基因检测以确诊是否为希特林蛋白缺乏症，从而及时采取有效的临床干预，以改善患儿的生存质量。本研究即以中国人群中SLC25A13基因3种常见突变c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A为靶点[5-7]，采用特异性探针实时荧光PCR解链曲线分析技术策略，建立了一种希特林蛋白缺乏症快速基因分型方法，报道如下。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 Slan-96S实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗公司)；dNTPs、High Affinity HotStart Taq酶及配套PCR缓冲液等购自北京天根生化科技公司：PCR产物纯化试剂盒及全血基因组DNA提取试剂盒(柱提法)均购自德国Qiagen公司。

1.2样本来源 从南方医科大学医学遗传学教研室样本资源库中，随机选取1例正常个体基因组DNA(gDNA)样本，以此样本为基础，采用定点诱变技术[8-9]分别构建SLC25A13基因c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A突变质粒DNA，用于方法学研发及检测体系优化。从佛山市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心收集新生儿筛查干血斑40例，均为2017—2019年样本，其中正常基因型30例、c.851-854delGTAT突变纯合子3例、c.851-854delGTAT突变杂合子2例、c.1638-1660dup23突变杂合子2例、c.851-854delGTAT/c.1638-1660dup23突变双重杂合子1例、IVS6+5G>A突变杂合子2例。干血斑样本用DNA 提取试剂盒按说明书提取gDNA以备用。所有SLC25A13基因突变阳性样本均经Sanger测序确诊，且患儿或其家属均已签署知情同意书，用于方法学的应用与评价。

1.3技术策略及引物探针设计 参照本课题组的实时荧光PCR解链曲线基因突变检测通用技术方案及技术发明专利[10-11]，根据SLC25A13基因(NC_000007.14)DNA序列中c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A突变位点所在位置，分别设计相应的PCR扩增引物、荧光标记及对应淬灭探针。其中，针对2种突变类型分别采用不同的荧光标记探针设计方案：针对c.851-854delGTAT、IVS6+5G>A等In/Del或点突变类型，以突变位点野生型或突变型的互补DNA序列为探针，利用探针与野生型和突变型的杂交/解链温度差异而实现检测目标；针对c.1638-1660dup23等片段插入或缺失突变类型，则分别设计Tm值不同的野生型和突变型探针。PCR扩增引物及荧光/淬灭探针见表1，均由上海生工生物公司合成。

表1 各SLC25A13基因突变位点的PCR扩增引物及荧光/淬灭探针

1.4多重PCR荧光探针解链曲线检测体系的建立 反应体系总体积为25.0 μL，含10×HA buffer(15 mmol/L MgCl2)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL、5.0 U/μL High Affinity HotStart Taq酶0.3 μL、5.0～20.0 ng gDNA模板或10.0～20.0 pg质粒DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L上、下游引物各0.5 μL、10.0 μmol/L荧光标记/淬灭探针各0.1 μL，ddH2O补足体积。于Slan-96P 实时荧光PCR仪，以仪器配套软件，设置反应条件与参数为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35个循环，72 ℃再延伸10 min，95 ℃变性5 min，40 ℃杂交10 min，42～70 ℃解链分析采集荧光信号。

1.5基因分型结果判读及方法学评价 以各突变位点野生型和突变型质粒DNA为样本，用已建立的反应体系进行检测，据各样本的解链曲线结果图，确定各突变位点野生型和突变型的解链曲线Tm值。分析受检样本时，根据各突变位点的解链曲线Tm值结果而判定基因型(图1)：如3个突变位点均只有野生型Tm值解链峰结果，为排除这3个位点突变的正常样本；如其中某突变位点只有突变型Tm值解链峰结果，基因型为此位点突变型纯合子；如其中某突变位点有野生型和突变型Tm值解链峰结果，基因型为此位点突变杂合子；如结果显示有2个位点的突变杂合，基因型即为此2个位点的突变双重杂合子。

将已收集的40例已知基因型血斑标本gDNA，盲法编号后用所建立的方法进行分析，判断本方法所检测的基因型结果与已知的基因型结果进行相符率计算，评价所建立方法的敏感性与特异性。

2 结果

2.1希特林蛋白缺乏症实时荧光PCR解链曲线快速基因分型方法评价 建立的实时荧光PCR解链曲线快速基因分型方法能对人类希特林蛋白缺乏症SLC25A13基因c.851-854delGTAT、IVS6+5G>A和c.1638-1660dup23位点的野生型和突变型进行准确检测，实现希特林蛋白缺乏症的快速基因分型，基因型的解链曲线结果见图1。

注：蓝色为FAM荧光通道，检测突变位点为c.851-854delGTAT，野生型和突变型的解链Tm值分别为(62.0±0.5)℃和(57.0±0.5)℃;绿色为HEX荧光通道，检测突变位点为c.1638-1660dup23，野生型和突变型的解链Tm值分别为(52.0±0.5)℃和(57.0±0.5)℃;黄色为ROX荧光通道，检测突变位点为IVS6+5G>A，野生型和突变型的解链Tm值分别为(62.5±0.5)℃和(58.5±0.5)℃;A,正常样本;B,c.851-854delGTAT突变纯合子；C,c.1638-1660dup23突变杂合子；D,IVS6+5G>A突变杂合子。

2.2临床样本检测及方法学评价 40例已知基因型干血斑gDNA样本，盲法编号后采用本方法检测，各样本的基因型结果均与已知基因型相符，结果显示此方法的敏感性与特异性均达100%。

3 讨论

希特林蛋白缺乏症是一种遗传代谢病，中国人群的基因突变携带率高达1/63[12-14]。此病临床表现复杂，症状无特异性，早发现、早确诊、早干预，对提高患儿生活质量、提高人口素质和健康水平具有重要意义。在目前希特林蛋白缺乏症诊断的临床实践中，主要是根据患者的临床症状和生化指标(儿童或成人)，或新生儿筛查异常指标，通过目的基因PCR扩增及DNA测序进行基因诊断[15-18]。希特林蛋白缺乏症SLC25A13基因序列长、突变位点分散，此传统技术策略只能对各个突变位点分别进行PCR扩增和DNA测序，操作繁琐、耗时长、成本高。近年来，随着遗传代谢病研究的深入及新生儿疾病筛查的普及，对希特林蛋白缺乏症的认识及重视程度也逐年提高，简单实用、准确可靠的基因诊断方法，也正是当前希特林蛋白缺乏症常规基因诊断及人群分子筛查的现实所需。

相关报道显示，SLC25A13基因突变谱以高频突变为主，我国人群中，c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23最常见，IVS6+5G>A次之[5,14,19-22]。本研究即以此3种高频突变为靶点，采用三重实时荧光PCR解链曲线技术，建立了一种希特林蛋白缺乏症靶基因位点快速基因分型方法。应用及评价结果显示，本方法的解链曲线结果图直观而易于判读，且为一次性闭管操作，简单实用、准确稳定、低成本自动化，可作为当前希特林蛋白缺乏症SLC25A13基因常规分子诊断及人群分子筛查的适用方法。也必须强调的是，本方法是针对希特林蛋白缺乏症SLC25A13基因3种中国人群突变热点的快速基因分型；此范围之外的其他突变位点或突变类型，须采用其他技术方法进一步检测分析，也可根据本研究采用的通用技术策略而构建相应突变位点的快速检测方法。