诱导多能干细胞治疗青光眼的研究进展

谈思益 综述，康伟超 审校

(徐州医科大学：1.第二临床医学院；2.麻醉学院，江苏 徐州 221004)

人眼是人体结构中最复杂的结构之一，由数百万个具有不同细胞类型的组织构成。眼睛在解剖学上可分为前部和后部。前部包含角膜、虹膜、瞳孔和晶状体，后部则由巩膜、脉络膜、视网膜、黄斑和视神经组成。光线通过角膜和晶状体进入眼内，位于眼后的视网膜将聚焦的光的输入转变为电信号的模式，然后传输到大脑形成周围环境的视觉图像，但视觉处理的第一步发生在视网膜。

1 视网膜发育的过程

视网膜起源于神经系统发育形成的神经外胚层，因此，视网膜也被认为是大脑的一部分[1]。超过30%的大脑功能是分析眼睛携带的光的信息[2]。视网膜神经节细胞(RGC)是视网膜中最先出现的细胞类型之一，紧随其后的是无长突细胞、视锥细胞和水平细胞。在视网膜发育的后期，产生杆状细胞，接着是双极细胞，最后是Müller胶质细胞。RGC位于视网膜结构中的最内层，光感受器则更多地占据外围层。一些细胞外信号分子调节眼的发育过程，包括Wnt[3]、胰岛素样生长因子(IGFs)[4]、成纤维细胞生长因子(FGFs)[5]、Notch、骨形态发生蛋白(BMPs)、维甲酸(RA)[6]。这些细胞外信号分子在发育的不同阶段出现，以调节一系列不同的发育事件。RGC是连接到大脑轴突的小神经元，将光信号发送到大脑指定区域，如外侧膝状核或视上丘，作为视网膜的最终输出[7-8]。因此，RGC有更大的细胞体和更粗的轴突，这都是动作电位远距离传播所必需的[9-10]。这些轴突在神经纤维层中聚集在一起形成视神经。RGC在将视觉信息从眼睛传递到大脑中起着至关重要的作用。当RGC的传导因疾病或损伤被切断，从而抑制光信息到达适当的处理中心，进而导致视力丧失和失明。

2 青光眼疾病的特点

青光眼是一组以RGC进行性退化为特征的视网膜疾病，是不可逆转失明的主要原因之一。据估计，全球有超过7 600万人受青光眼影响，2040年影响约1.118亿人[11]。我国40岁以上人群青光眼患病率为1.5%～3.6%[12]。尽管青光眼在全球普遍流行，但目前还没有有效的治疗方法来治疗RGC的退化和随后的视野损伤。目前针对青光眼的治疗大多数都旨在降低眼压来限制视力丧失的进展，因为高眼压是青光眼唯一确认的可改变的危险因素[13]。然而青光眼也可以在正常眼压下发生[14]，所以降低眼压不能有效防止视力丧失。因此针对RGC退变及视力损伤机制的研究，以及RGC的移植替代研究具有重要的意义。

各种用于治疗青光眼的细胞疗法正在研究当中。青光眼明显的表现是RGC的丢失。传统对抗RGC变性的方法是依赖于在疾病过程的早期阶段进行治疗，此时神经保护仍然有效。实际上大多数视神经病变患者在诊断时已经产生了显著的RGC丢失，并且在疾病的后期阶段，大量不可逆转的细胞丢失使得神经保护变得徒劳。在这种情况下，移植健康的RGC以取代退化的细胞是恢复视觉功能的最后选择。然而，由于RGC轴突的远距离投射及有效地恢复突触的功能性等障碍，RGC的替代策略一直缺乏成功的发展。目前干细胞疗法已经在帕金森病和脊髓损伤等神经退行性疾病中被证明具有改善作用，治疗的成功在于对损伤、丢失的神经元进行替换。实际上，由于人眼是脊椎动物体内的免疫优势部位，因此一直处于干细胞移植研究的前沿[15]。移植细胞的免疫排斥问题是决定移植后细胞能否在宿主体内存活并良好整合的关键。而由于血-眼屏障、眼内腔的免疫抑制微环境和前房相关的免疫偏离存在使眼具有了独特的免疫赦免条件。此外，移植细胞的作用机制不仅在于完成细胞整合和补充的任务，还在于提供神经保护环境，产生生长因子和细胞因子，减缓神经退变过程，恢复视功能。

3 神经节细胞的标志物

RGC功能特性可作为鉴别和纯化筛选细胞的依据之一。RGC具有对谷氨酸做出反应的能力[16-17]，还表现出兴奋性突触后电位(EPSPs)[18]。在分化培养中为了将RGC与其他类型的细胞区分开，使用一些分子标记可以将其识别出来。早期使用遗传标记TUJ1作为RGC样细胞的共同标记[19]，RGC表达这种标记，但不具有特异性，因为中枢神经系统中也有许多投射神经元表达此标记[20]。用于识别RGC的最常见的转录因子是BRN3。BRN3由视网膜内的RGC特异性表达。然而，BRN3的表达也存在于体感神经元和听神经元中[21]。免疫荧光是一种纯化RGC的技术，其利用RGC表达的表面抗原Thy-1的RGC特异性表达。使用两步法，可以从出生后的大鼠视网膜获得99.5%以上纯度的RGC培养[22]。虽然Thy-1特异性地表达在视网膜内的RGC中，但这个标记在神经系统的许多其他类型的神经元中都有表达[23]。因此，必须注意不能仅仅依靠一个标记鉴别,而应该结合遗传标记、形态特征和功能特征的组合表达才能鉴别RGC。目前关于RGC发育和成熟的研究发现RGC具有多样性，在动物模型中发现和鉴定了30多种在分子、形态和生理特性上不同的亚型[24]。这些亚型表达特定的分子标记，具有不同的分子、结构和功能特征[24]。虽然在动物模型中已经观察到大多数RGC亚型，但最近有研究在人类多能干细胞(hPSC)分化得到的RGC中也发现了不同亚型的存在[25]。这些动物研究不仅描述了这许多亚型的复杂性，还观察了急性损伤或疾病后不同亚型的存活和再生现象[26]。接下来应该集中于如何将特定的亚型从hPSC中区分出来，以便正确理解不同视神经疾病中特定RGC亚型的退变情况，为今后在细胞替代研究和治疗中解决退行性细胞丢失问题提供更多的了解。

4 视网膜移植细胞的来源

目前用于移植的各种细胞来源大致可分为成体组织来源的干细胞、胚胎来源的干细胞、祖细胞和多能干细胞。多能干细胞(PSC)目前被认为是最好的细胞来源，hPSCs可以产生视网膜再生所需的所有细胞类型[27]。2006年，TAKAHASHI等[28]发现诱导多能干细胞(iPSC)几乎可以从人体的任何细胞中人工地制造出来，并具有与胚胎干细胞相同的功能，如无限增殖、自我更新和分化为3个胚层的能力。iPSCs可以提供自体干细胞的来源，而不需要考虑使用胚胎干细胞需要破坏胚胎的伦理问题。因此，iPSCs非常适合用于干细胞移植和体外疾病模型的建立。对于iPSC分化的过程包括2个步骤：首先细胞失去其特有的特征，呈现出一种较低分化程度的状态；其次，细胞分化过程重新启动，通过特定的生长因子、细胞因子和细胞外基质分子的参与，开始新的分化过程。

5 细胞移植面对的问题

5.1形成肿瘤 PSC的使用也会产生形成肿瘤的问题。未分化的iPSC可以存在于分化的细胞集落中，一同移植可能会导致畸胎瘤的形成。因此需要提高移植细胞的纯度，来避免移植后畸胎瘤的形成。

5.2细胞数量 虽然各种分化方法都可以产生视网膜神经元，但这些方法中大多数仍然不能大量地产生除视杆细胞以外的特定视网膜神经元。因为体外干细胞培养方法模拟了在体内正常视网膜发育的过程，并且在小鼠和人的视网膜中，视杆细胞的数量远远超过RGC[29]。干细胞来源的RGC的平均产量估计为培养细胞的0.1%～30.0%，这与不同发育阶段视网膜中RGC的正常比例相似。

5.3突触形成 RGC作为视网膜的投射神经元，需要将长轴突延伸出眼睛，进入大脑并形成突触，并正确地连接到突触后靶点。RGC轴突受限于眼内结构的空间限制，目前没有发现向外延伸到特定靶点的特性。

5.4免疫反应 虽然，主要组织相容性复合体(MHC)在许多类型的干细胞中的表达很低，但分化的组织表达MHC，这种表达会导致免疫排斥。即使是自体小鼠iPSC也可以诱导免疫反应，产生类似自身免疫反应。最大限度地减少手术创伤对于减少固有免疫(如自然杀伤细胞和树突状细胞)的激活具有重要的意义，固有免疫反过来可以激活获得性免疫反应。

6 iPSC的应用

iPSC为研究人类视网膜退行性疾病提供了一个独特的工具，包括青光眼等以RGC为靶点的视神经疾病。由于RGC连接眼睛和大脑之间视觉信息的传递，它们的退化会导致视力丧失，最终导致失明。在过去，动物模型如猫、狗、鸡、猪，特别是啮齿动物，被用来研究一些视网膜疾病相关的致病机制，使我们对疾病的许多关键方面有了更多了解[30]，但有时由于物种之间的差异使得在临床环境下移植到人类身上时会失败[31]。例如，老鼠是夜间活动的动物，它们的视网膜主要由视杆细胞组成，光感受器仅含有少量的视锥细胞(所有光感受器的3%)，这与人类视网膜存在显著差异。并且，人类的眼睛在许多方面都是独一无二的，例如密集斑点和三原色的组成。因此，并不是所有的疾病和药物反应都能在动物模型中得到充分反映。iPSC衍生的RGC模型是筛选能够改善疾病药物高度相关的，与在动物模型上的测试相比，在临床上具有更高的成功潜力。

以人类来源的疾病模型发展，可以产生和研究患者特有的细胞。许多基于hPSC的RGC变性的遗传模型，例如青光眼变性在过去几年中已经发展起来[32]，包括Six6、TANK结合激酶1(TBK1)和视神经磷酸酶(OPTN)的突变，这些都与家族性正常眼压性青光眼(NTG)的发病有关。Six6因其在眼睛发育和形态发生中的作用而广为人知，尽管这种转录因子的突变也被认为会导致NTG的发生[33]。来自Six6错义突变患者的hPSC产生神经节细胞和视网膜细胞的效率低下，关键发育基因的表达减少和表达失调[34]。此外，Six6错义突变患者RGC表现出严重的发育、形态和电生理缺陷，轴突生长减少，轴突引导分子表达不足。此外，Six6错义突变的RGC表现出明显更高的活化caspase-3水平。据推测，Six6中的这种错义突变会导致RGC发育缺陷，这可能会使这些RGC在成年后面临更高的退化风险。这些研究结果为开发新的视网膜退行性疾病治疗方法提供了更多的思路，如果使用得当，基于PSC的视网膜模型对于深入了解许多疾病方面是有益的。

从患者来源的人iPSC生成个性化视网膜细胞也为个性化药物治疗提供了新的可能性。hPSC定向分化的RGC也为大规模的药物筛选提供了大量细胞，然后可以特异性地针对RGC来评估化合物对疾病的疗效。

7 移植手术的方式

目前考虑2种神经节细胞替代方式，即以分离的细胞悬浮液的形式移植或以预先形成的视网膜片状移植。注射细胞悬液与片状移植比较的优势在于：(1)可以精确地控制细胞移植的数量；(2)供体和宿主视网膜细胞形成更好的接触；(3)手术微创，减少术后并发症；(4)更容易标记供体细胞。另一方面，高度退化的视网膜非常薄，并显示出大量的胶质瘢痕，因此视网膜薄片移植所需的更复杂的手术入路可能会增加瘢痕形成和纤维化的风险。

全层视网膜薄片可以卷成套管，注入宿主视网膜的视网膜下间隙。大多数研究的主要目的是恢复光感受器功能[35]，但在此过程中也移植了RGC。然而，在猫和猪移植试验中，几乎没有观察到供体与宿主视网膜组织的整合，这表明视网膜薄片可能不是实现RGC移植的有效途径。

目前有研究团队没有使用视网膜薄片进行移植，而是提纯了出生后的小鼠视网膜细胞，并将它们通过玻璃体内注射的方式移植到成年啮齿动物视网膜上[36]。实验结果表明，从较早期(胚胎或出生后早期)分离的RGC在移植后存活率较高。尽管RGC移植的成功率很低，但一些RGC移植到宿主视网膜的玻璃体内，产生了内源性RGC的正常形态，对光有反应，甚至与外侧膝状体和视上丘建立了突触联系。

WANG等[37]将从胚胎干细胞(hESC)诱导分化出的视杯状结构中提取大约20 000个RPC移植到N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)处理的小鼠玻璃体腔中。观察发现，其中约0.5%的细胞在移植后5周成功整合到NMDA处理的小鼠视网膜中。存活的移植细胞遍布整个神经节细胞层(GCL)，与宿主残留的RGC在小鼠视网膜GCL内呈互补分布。这些RGC投射到视神经的能力表明，hESC来源的供体细胞可能具有整合到宿主视网膜和中枢神经系统回路的能力。这些研究表明，hESC来源RGC移植是可能的，尽管效果不是很好。

8 小 结

在过去的研究中，hPSC已经被用来探究不同类型的视网膜细胞发育和各种神经退行性疾病。但大多数的研究着眼于视网膜外层细胞的疾病，利用hPSC来研究RGC疾病的试验是缺乏的。目前运用hPSC来治疗RGC疾病还存在以下几个关键的问题需要解决：(1)移植细胞的手术方式选择(以细胞悬液还是视网膜薄片)，并培养能够掌握手术的临床医生；(2)从hPSC中区分出特定的亚型，正确理解不同视神经疾病中特定RGC亚型的退变情况；(3)移植细胞分化和成熟程度；(4)疾病的最佳移植时期。另外，随着生物工程技术的发展，生物材料在移植中的运用被重视起来。一些生物相容性好的、坚固耐用的材料，如胶原、聚酯、聚环己内酯、聚酰亚胺和对苯二烯等被用来避免移植损伤和免疫反应。我们有理由相信，在不久的将来一些目前难以被治愈的视网膜神经退行性疾病在干细胞移植技术合理运用下可得到突破性的进展。