瑶药止痛散质量标准研究*

莫海玲，蒋璐慧，农英高，李以军，林素梅，周海坚

（广西壮族自治区民族医院·广西医科大学附属民族医院，广西 南宁 530001）

瑶药止痛散由毛两面针、洋金花、草乌、山乌龟、莪术等10 味药材组方，可解毒散结、消肿止痛、补气行血、温通经络，且使用较安全[1-3]，临床多用于治疗癌性疼痛。方中毛两面针、洋金花、草乌为君药，毛两面针为芸香科植物毛叶两面针的干燥根和茎，瑶药称入山虎，是瑶药“五虎”之一[4]，具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络的功效，其主要有效成分为氯化两面针碱。洋金花为茄科植物曼陀罗，瑶药称辣喝咪[5]，具有止咳平喘、麻醉止痛、散瘀消肿、镇静安神功效，主要有效成分为东莨菪碱、莨菪碱、曼陀罗碱等。草乌具有祛风除湿、温经止痛功效。莪术、山乌龟为方中臣药，山乌龟具有清热解毒、理气止痛的功效[5]，莪术具有行气破血、消积止痛功效。瑶药止痛散目前尚无质量标准，为确保该制剂在临床使用的安全性和有效性，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中毛两面针、洋金花、草乌进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对毛两面针的主要有效成分氯化两面针碱进行定量分析，为制订瑶药止痛散的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030 型高效液相色谱仪，包括紫外检测器、柱温箱、LabSolutions 色谱数据工作站（日本Shimadzu 公司）；XS 205 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.1 mg / 0.01 mg）；KQ-300DB 型数控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；HHitech 和泰水纯化系统（上海和泰仪器有限公司）；DLF-28 型分级连续投料粉碎机（温州顶级医疗器械有限公司）。

1.2 试药

瑶药止痛散（本院自制，批号分别为20190607，20190608，20190609）；氯化两面针碱对照品（批号为110848-201604，纯度为91.0%），氢溴酸东莨菪碱对照品（批号为100049-201009，纯度为91.7%），乌头碱对照品（批号为110720-201111，纯度为98.8%），次乌头碱对照品（批号为110798-201308，纯度为98.6%），洋金花对照药材（批号为121058-200503），草乌对照药材（批号为121338-200401），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；二甲苯、乙酸乙酯、甲醇、异丙醇、浓氨试液、磷酸等均为分析纯；水为纯化水。

1.3 药材

毛两面针（批号为1809034）、洋金花（批号为1811151）、草乌（批号为D1703003）、山乌龟（批号为1811081）、莪术（批号为1811092）等药材均购自广西张益堂中药饮片有限公司，经我院周海坚副主任中药师鉴定为正品，作为对照药材。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

毛两面针：取样品3 g，精密称定，加乙醇40 mL，超声（功率300 W，频率40 kHz，下同）处理60 min，放冷至室温，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液；取毛两面针对照药材2 g，同法制成对照药材溶液；按止痛散处方和工艺制备缺毛两面针的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液；称取氯化两面针碱对照品适量，精密称定，用乙醇溶解，制成氯化两面针碱质量浓度为0.025 mg/mL 的对照品溶液。按2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法[6]试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（10∶2.5∶2.5∶0.5∶0.05，V/ V/ V/ V/ V）为展开剂，置紫外光灯（波长365 nm）下检视[7]。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[8]。详见图1 A。

洋金花：取样品3 g，精密称定，加浓氨试液5 mL，混匀，加三氯甲烷20 mL，摇匀，静置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液；另取洋金花对照药材2 g，同法制成对照药材溶液；按止痛散处方和工艺制备缺洋金花的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液；精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品，用甲醇溶解，制成氢溴酸东莨菪碱质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。按2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法[6]试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试液（20 ∶3.5 ∶0.5，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液[9]。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[8]。详见图1 B。

草乌：取样品3 g，精密称定，加氨试液10 mL 润湿，加乙醚20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液；另取草乌对照药材2 g，同法制成对照药材溶液；按止痛散处方和工艺制备缺草乌的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液；精密称取乌头碱对照品、次乌头碱对照品，用异丙醇-三氯甲烷（1 ∶1，V/ V）混合溶液溶解，制成乌头碱、次乌头碱质量浓度均为1 mg/mL 的混合对照品溶液。按2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法[6]试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内20 min，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[8]。详见图1 C。

图1 薄层色谱图1-3.test solution（batch numbers：20190607，20190608，20190609） 4.reference solution 5. reference material solution 6.negative reference solution A. Zanthoxylum nitidum B. Datura metel C. Radix Aconiti kusnezoffii Fig.1 TLC chromatograms

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge Phengl C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液-三乙胺（20 ∶80 ∶1，V / V / V）；检测波长：271 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取氯化两面针碱对照品2.5 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为50 μg / mL 的对照品贮备液；精密量取1 mL，加70%甲醇溶解，并定容至10 mL，摇匀，即得氯化两面针碱质量浓度为5 μg / mL 的对照品溶液。

供试品溶液：取样品3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇20 mL 超声处理30 min，滤过；滤渣和滤纸加70%甲醇20 mL 超声处理30 min，放冷至室温，滤过，滤液置同一容量瓶中，加70%甲醇洗涤3 次，洗液并入50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

阴性对照品溶液：按止痛散处方和工艺制备缺毛两面针的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2.2 项下对照品溶液、供试品溶液各适量，按选定色谱条件进样测定，色谱图见图2。结果理论板数按氯化两面针碱峰计应不低于2000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

专属性试验：取上述对照品溶液、阴性对照溶液各适量，按选定色谱条件进样测定，色谱图见图2。结果阴性对照品溶液在与氯化两面针碱对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。

图2 高效液相色谱图1. nitidine chloride A. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，制成系列对照品溶液。取上述溶液各10 μL，按选定色谱条件进样测定，记录峰面积。以氯化两面针质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=55065.1X+5178.40（r=0.9996，n =6）。结果表明，氯化两面针碱质量浓度在1.25 ～12.50 μg / mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取对照品溶液适量，按选定色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果氯化两面针碱峰面积的RSD为0.68%（n =6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号20190607）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，10，12 h 时进样测定，记录峰面积。结果氯化两面针碱峰面积的RSD为0.68%（n =6），表明供试品溶液在室温放置12 h 内基本稳定。

重复性试验：称取样品（批号20190608）适量，精密称定，同法制备供试品溶液，再按选定色谱条件进样测定6 次，记录峰面积，并计算含量。结果氯化两面针碱含量平均值为100.86 μg/g，RSD为1.16%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号20190608）2 g，精密称定，共6 份，分别加入1，2，3 mL 的氯化两面针碱对照品贮备液，同法制备供试品溶液，再按选定色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

样品含量测定：取3 批样品各适量，分别同法制备供试品溶液，再按选定色谱条件进样测定，平行测定3 次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 样品超声提取次数选择

在样品提取预试验中，考察了不同超声提取次数对氯化两面针碱含量的影响，结果超声提取2 次与提取3 次的含量差异不大，故确定为2 次。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of samples（n=3）

3.2 TLC 鉴别条件选择

在毛两面针的TLC 鉴别中，曾参考文献[4， 10-11]选择展开剂，结果发现各斑点分离效果不佳，拖尾严重，效果不理想。后参考文献[7]，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（10 ∶2.5 ∶2.5 ∶0.5 ∶0.05，V/ V/ V/ V/ V）为展开剂，结果各斑点显示清晰，分离度好。在洋金花的TLC 鉴别中，曾考察了乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17 ∶2 ∶1，V/ V/ V）及氯仿-甲醇-浓氨试液（20 ∶3.5 ∶0.5，V/ V/ V），结果以后者为展开剂，各斑点分离度好，且显色清晰，阴性对照无干扰。

在草乌TLC 鉴别中，曾考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V），乙酸乙酯-浓氨试液（20 ∶1，V / V）及乙酸乙酯-正己烷-浓氨试液（15 ∶5 ∶1，V/ V/ V），结果以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V）为展开剂时，各斑点分离度好，且显色清晰，阴性对照无干扰。

3.3 含量测定指标选择

氯化两面针碱是毛两面针的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌、镇痛、抗肿瘤活性[12-15]，含量测定方法较成熟[4，16-17]，本试验中结合瑶药止痛方的临床疗效及对疗效的贡献程度，最终确定以氯化两面针碱为考察指标。选用乙腈-0.2%磷酸溶液-三乙胺（20 ∶80 ∶1，V/ V/ V）为流动相，结果精密度、重复性、稳定性的RSD均小于2.0%，3 批样品中氯化两面针碱的平均含量为100.86 μg/g，平均加样回收率为100.28%，RSD为1.75% （n=6），表明该研究所建立的标准可用于瑶药止痛散的质量控制。