鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

刘 磊，王 讯，*，罗 毅，梁继元，颜培祺，李昕怡，刘 薇，刘辰恺，李佳佳

(1.四川农业大学 动物科技学院，四川 成都 611130；2.畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，四川 成都 611130)

鸽(Columbalivia)是一种较早被人类驯化的鸟类，其种类丰富、分布广泛，经济价值主要体现在观赏、竞赛、食用等方面[1]。此外，鸽也具有较高的科研价值，表现在鸟类导航机制的研究[2-4]、疾病模型的建立[5]，以及生物仿生学[6-8]等方面。其生长速度远高于其他常见家禽，雏鸽生长至28日龄时的体重是刚孵化出壳时体重的22倍[9]，这一快速生长的现象与其特有的消化生理功能密不可分。早期研究发现，鸽缺乏胆囊，胆汁从胆管排出后直接进入十二指肠，参与脂肪等营养物质的消化与吸收[10]。另有研究指出，鸽出壳当天小肠的质量比孵化12 d时增长了260.73%；出壳后14 d小肠质量比出壳当天增加了40.02%；其中十二指肠、空肠、回肠的质量在出壳当天比孵化至12 d时均增加了2倍以上[11]。

肠道是动物摄食后进行消化的主要场所，肠道黏膜表面分布着许多细小的微绒毛，绒毛根部下陷形成小肠隐窝，极大的表面积有助于肠道消化功能的实现[12]。肠道中还分布着许多小肠上皮细胞(intestine epithelium cells，IECS)，作为肠道的主要功能细胞，主要参与营养物质的消化、吸收，调控机体免疫水平和应激等[13]。肠黏膜通过IECS迁移、增殖、分化、凋亡等维持黏膜完整性的动态平衡，肠黏膜是机体更新速度最快的组织，IECS增殖是维持肠黏膜完整性的生理特征之一[14]。

迄今为止，鸡[13]、鹅[15]、兔[16]、猪[17]、鼠[18]等物种IECS的分离培养体系均已建立，而鸽作为我国继鸡、鸭、鹅之后的第4大家禽[19]，其IECS分离培养尚未见报道，相关研究相对滞后。建立鸽IECS的体外培养体系，可为研究家鸽肠道的发育机制、营养物质的吸收机制提供理想的细胞模型，有助于从消化生理的角度揭示其早期快速发育的机制。因此，本试验拟从16日龄鸽胚中分离培养原代鸽IECS并对其进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

16日龄的白羽王鸽鸽胚购自绵阳市丰茂肉鸽养殖专业合作社。

1.2 试剂与仪器

磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)(P1031-500，Solarbio)；DMEM高糖培养基(SH30243.01，Hyclone)；青链霉素混合液(P1400-100mL，Solarbio)；IV型胶原酶(C5138-100MG，Sigma)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(NTC胎牛血清，Natocor)；CCK8试剂盒(C0037，碧云天生物技术研究所)；细胞角蛋白8抗体(BA3152，武汉博士德生物工程有限公司)；FITC-羊抗兔IgG(BA1105，武汉博士德生物工程有限公司)；DAPI染色液(AR1176，武汉博士德生物工程有限公司)；SYBR®Prime-ScriptTMRT-PCR试剂盒(RR014A，TaKaRa)。

CO2培养箱(Thermo Scientific)；酶标仪(Thermo Scientific)；荧光倒置显微镜(Nikon)；T100 Thermal Cycler PCR仪(Bio-Rad)；高速冷冻离心机(Beckman Coulter)；凝胶成像系统(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 鸽IECS的分离纯化与培养

胶原酶消化法：取孵化16 d的鸽胚，用体积分数为75%的乙醇消毒并用酒精棉擦拭，转置无菌操作台，用镊子轻轻取出鸽胚，再用含10% FBS的DMEM高糖培养液(含双抗)清洗雏鸽3次后置于培养皿；打开腹腔，选取与肌胃相连部分的小肠约1 cm，将其置于新的培养皿中并加入10 mL含10% FBS的DMEM高糖培养液，再用镊子撕掉肠系膜等组织并将其剪开，用PBS清洗直至无杂质产生；将肠组织转至青霉素小瓶，加入5 mL培养液，将其剪碎至1 mm3大小后转移到新的15 mL离心管中，1 000×g离心5 min，巴氏吸管轻吹以分离上层IECS沉淀物和下层血细胞，重复2次除去血细胞杂质；加入1 mg·mL-1的Ⅳ型胶原酶(预热至37 ℃)后置于CO2培养箱中消化45 min(每5 min震荡1次防止其沉淀，直至消化成絮状物)；加完全培养基终止消化，轻轻吹打混匀细胞悬液，先后通过100 μm和40 μm细胞筛，均过滤3次，除去较大组织块和细胞团；继续1 000×g离心5 min，弃上清，加入完全培养基(含10% FBS、1%青链霉素溶液的DMEM高糖培养液)重悬细胞，均匀接种于培养瓶中并放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。

组织块贴壁法：用完全培养基浸润培养瓶后，将剪碎的小肠组织块均匀接种于培养瓶底部，倾斜培养瓶吸出多余的液体，小心翻转培养瓶后放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养；8 h后，取出培养瓶向其中缓慢加入配置完成的完全培养基，继续放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。

IECS纯化培养：胰酶消化过程中，大部分成纤维细胞对胰酶耐受力弱于IECS。待细胞完全贴壁后，利用2种细胞对胰酶耐受性不同的特性去除成纤维细胞，对IECS进行纯化。将纯化后的细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养基(含双抗)培养，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，每2 d更换1次培养液，每天在倒置显微镜下观察IECS的生长情况并拍照记录，连续观察7 d。

1.3.2 鸽IECS生长曲线绘制

将胶原酶消化法获得的IECS悬液按每孔1×104个接种于96孔培养板中，同时设立空白对照组(空白对照组只加等量培养液)，然后将培养板放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每天相同时间取5个细胞孔和3个空白对照孔加入CCK-8溶液20 μL，继续培养1 h后取出，用酶标仪在450 nm下测吸光度，重复测量3次，连续检测7 d。

1.3.3 鸽IECS免疫荧光鉴定

待细胞正常生长融合接近90%时，用PBS清洗4次，加入体积分数为4%的多聚甲醛(预热)，4 ℃固定30 min；固定完成后PBS清洗4次，加入封闭液(5%山羊血清，0.3%Triton®X-100，1×PBS配置)室温封闭60 min，阻断非特异结合；封闭完成后去除封闭液，加入配置好的细胞角蛋白8抗体(1:400稀释)，4 ℃孵育过夜；加入PBS清洗3次，每次5 min，随后加入FITC标记的羊抗兔二抗(1:750)进行避光孵育1.5 h，PBS缓慢清洗3次，每次5 min；加入DAPI染色液对细胞核进行避光染色7 min，PBS缓慢清洗3次，每次5 min，封片后置于荧光显微镜下观察，拍照记录。

1.3.4 基因表达分析

将细胞生长融合接近90%的培养瓶取出，弃培养液，PBS漂洗，加入Trizol试剂裂解细胞并提取细胞总RNA；测定提取RNA的浓度与吸光度值后用TaKaRa逆转录试剂盒反转成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR反应，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性60 s，60 ℃复性60 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。根据鸽紧密连接蛋白基因CLDN-3、CLDN-4和β-actin基因序列，使用NCBI-Primer设计引物(表1)，并由四川擎科生物公司合成。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of RT-PCR primers

2 结果与分析

2.1 鸽IECS的分离培养与纯化

胶原酶消化法分离所得细胞在培养1 d时开始贴壁，贴壁细胞形态特征明显，呈多角形或鹅卵石样(图1-A)；培养至3 d时，细胞胞质丰富、状态良好，开始增殖(图1-B)；5 d后细胞大量增殖(图1-C)；培养至7 d时细胞汇集成片，呈铺路石状铺满培养瓶底(图1-D)。说明本试验构建的细胞培养体系较适合鸽IECS生长发育。组织块贴壁1 d后，组织块周围便有细胞游出，同时一些未贴壁的细胞团块悬浮于培养液中(图2-A)；培养至3 d时，更换培养液继续培养，死亡细胞明显减少，新生细胞从组织块中游离出来并贴壁生长(图2-B)；培养至5 d时，细胞聚集生长，形成细胞集落(图2-C)；7 d后细胞铺满瓶底，呈铺路石状排列，单层生长不重叠(图2-D)。鸽IECS纯化前，培养瓶中细胞种类较多、形态不一且死亡细胞较多(图3-A)；胰酶消化过程中，大部分成纤维细胞对胰酶耐受力弱于IECS。利用2种细胞对胰酶耐受性不同的特点进行纯化，将耐受力较低的成纤维细胞等去除，纯化后的贴壁细胞呈现多角形或者鹅卵石形(图3-B)。

2.2 鸽IECS生长曲线的绘制

为了解鸽IECS在培养过程中的生长变化情况，我们采用CCK-8法对其活性进行检测，并绘制生长曲线。如图4所示，接种后1～2 d，细胞活性较低、增殖缓慢；第3～4天细胞进入对数生长期，活性增强、增殖速度加快，到第4天时活性最强；5～7 d，细胞快速增长后发生接触抑制，活性逐渐降低。整个培养周期内生长曲线呈“S”形，符合细胞的生长规律。

2.3 鸽IECS鉴定

2.3.1 免疫荧光染色结果

用细胞角蛋白8抗体对纯化后的细胞进行荧光染色。如图5-B所示，在FITC标记的抗体孵育下，细胞表面呈现绿色荧光，经DAPI染色后，细胞核呈现蓝色荧光(图5-C)。Merge之后绿色荧光分布在蓝色荧光周围，表明所分离的鸽IECS经纯化后细胞纯度较高。

2.3.2 基因表达分析

紧密连接蛋白-3和紧密连接蛋白-4是上皮细胞具有的结构组成部分，对紧密连接蛋白-3基因(CLDN-3)和紧密连接蛋白-4基因(CLDN-4)进行RT-PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，CLDN-3和CLDN-4在分离的细胞中有表达，证明该试验分离所得细胞为鸽小肠上皮细胞。

3 结论与讨论

目前小肠上皮细胞的分离方法主要有组织块培养法、非酶消化法(螯合或解聚溶液)和酶消化法[20]。组织块培养法是最常使用且操作较为简单的方法，詹康等[17]和李艳等[13]采用组织块法成功分离了原代猪IECS和鸡IECS，且获得的原代IECS活性强、增殖速度快。此法对原材料要求高，多选择增殖能力强、污染少的胚胎或新生动物，可减少细菌污染。本试验选择16日龄鸽胚为试验材料，此时鸽胚并未接触外界环境，可避免来自消化道微生物的污染，同时能够保证有足够的小肠组织。最终本试验采用组织块培养法成功从小肠组织块中分离出大量单层细胞，获得了活性强、增殖速度快的原代鸽IECS。

酶消化法分离IECS可以消除一些细胞和细胞之间的相互作用，尤其是上皮细胞和隐窝成纤维细胞之间的相互作用。选用合适的消化酶和确定适宜的消化时间以消化分离出肠隐窝细胞团是IECS体外培养成功的关键。有研究表明，使用胰蛋白酶消化法可以成功分离鹅[15]和人[21]的IECS，但胰蛋白酶对细胞伤害较大且得到的IECS大部分为单细胞，细胞贴壁和生长能力较弱。而胶原蛋白酶对细胞间质有消化作用，对上皮细胞影响不大，是比较理想的消化酶。刘飞飞等[22]使用Ⅳ型胶原酶分离兔IECS，效果良好；其他研究发现，同时使用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ[23]，以及同时使用胶原酶Ⅺ和胶原酶Ⅰ[24]也能够获得贴壁和生长能力良好的IECS。这表明不同物种的适宜消化酶不同。本次研究发现，使用0.1% Ⅳ型胶原酶能够获得细胞状态良好、活性较强的原代鸽IECS。

在IECS原代培养试验中最大的干扰因素是分离所得细胞中还夹杂着大量的杂细胞，主要指成纤维细胞，少量异源细胞对IECS的生长繁殖也是有利的，但过度繁殖会抑制IECS生长[25]。由于IECS和成纤维细胞对胰酶的耐受性不同，本试验采取相差消化法对细胞进行纯化。待细胞完全贴壁生长一段时间后，加入胰酶进行短时间处理，成纤维细胞对胰酶作用非常敏感先被消化下来，吸去培养液后对余下的细胞进行收集，从而获取较纯的IECS(其形态为多角形或鹅卵石形，这是IECS的典型形态)。通过组织块贴壁法和胶原酶消化法都可成功分离出IECS，但相比而言，组织块贴壁法操作更简单，分离成本更低。

经过纯化后，倒置显微镜下观察细胞生长状态和形态特征发现，视野中绝大部分细胞呈现多角形或者鹅卵石形，为IECS的典型状态。继续培养至细胞长满瓶底，发现细胞呈铺路石状排列。通过光学显微镜可以观察到细胞具有IECS的基本形态，但据此并不能准确鉴定为IECS；因为相关研究表明，在培养过程中成纤维细胞占有优势，当细胞达到一定密度时，开始相互挤压，从而改变梭形成纤维细胞原来的形态，呈现与IECS类似的铺路石状[26]。而细胞角蛋白是一类具有高度特异性的上皮细胞标志性蛋白，对上皮细胞的骨架和形态保持具有重要的生理作用，其在成纤维细胞中不表达。本试验利用细胞角蛋白8对所分离的细胞进行鉴定，结果发现，细胞有阳性结合。李小芬等[27]、李艳等[13]也用此法成功鉴定了IECS。此外，细胞间连接复合体是肠道黏膜屏障的重要组成部分，紧密连接作为细胞间连接复合体最重要的连接方式，其功能是只允许小分子可溶性物质通过，同时对毒性大分子和微生物的通行进行阻碍，这种特殊生理功能使肠道屏障的正常生理功能得以维护[28]。作为肠道黏膜屏障中机械屏障的重要组成部分和上皮细胞的结构组成部分，紧密连接蛋白具有多种功能[29]，它不仅能维持上皮屏障功能、阻碍有毒大分子和微生物入侵，还能选择性调节小分子物质和离子进入体内[30]。此外，紧密连接蛋白还参与基因转录、细胞增殖和分化状态的调节[31]，紧密连接蛋白-3和紧密连接蛋白-4是其家族成员。本试验对紧密连接蛋白基因CLDN-3、CLDN-4的表达进行分析，结果表明，紧密连接蛋白基因CLDN-3、CLDN-4在所分离的细胞中均有表达，与范斌等[16]的研究结果一致。多种鉴定方法互补证明，我们成功分离培养了鸽IECS。本研究中鸽IECS的生长曲线为先升后降趋势，与李小芬等[27]对山羊IECS生长曲线的研究结果一致。

综上所述，本研究使用胶原酶消化法和组织块贴壁法均可以成功分离鸽小肠上皮细胞，并采用相差消化法对其进行纯化。通过免疫荧光分析和基因表达分析鉴定了分离得到的细胞为小肠上皮细胞。绘制的细胞生长曲线表明，本试验分离的小肠上皮细胞符合一般细胞的生长发育规律。本研究将为雏鸽肠道营养的研究提供理想的细胞模型，为后续从细胞水平研究家鸽营养物质的吸收机制和特征做铺垫。