镉胁迫下黑曲霉TL-F2的促生特征及其对黑麦草种子萌发、幼苗生长和镉含量的影响

刘 如，董畅茹，张祎雯，屈铭慧，张 伟，洒海洋，陈海燕，叶文玲，樊 霆

(安徽农业大学 资源与环境学院，农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室，安徽 合肥 230036)

镉(Cd)是毒性极大的重金属，具有生物蓄积性强、毒性持久、难去除、易迁移转化等特点[1]。据2014年《全国土壤污染状况调查公报》，我国耕地土壤污染点位超标率达19.4%，其中Cd超标点位数占全部超标点位数的7.0%[2]。Cd污染农田对食品安全、人体健康和生态环境都构成了严重威胁，制约区域土地的可持续开发利用[3-4]。植物和微生物修复与传统的物理化学修复方法相比，具有成本低、效果良好和环境友好等特点，其机理研究与应用前景备受关注[5-7]。但是，目前国内外发现的Cd超富集植物种类较少，且自然生长环境条件下具有生物量小、生长缓慢和环境抵抗能力弱等缺陷，制约了植物修复在实际工程中的大规模应用[8]。黑麦草(LoliummultiflorumL.)为一年生或多年生草本植物。一年生黑麦草具有较高的生物乙醇转化率，已被应用到发酵等工业领域[9]。同时，黑麦草对Cd、Zn、Pb、As、Cu等具有较强的抗性和富集作用，分蘖力强，生长速度快，且季节适应性较强，可用于重金属修复[10]。

研究发现，植物促生菌可促进植物在重金属胁迫环境下吸收营养，促进植物根际对重金属的吸收、转运和积累，增强植物抗逆性，提高修复效率[11-13]。如接种荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，除可提高紫茉莉(Mirabilisjalapa)在重金属污染土壤中的种子萌发率、增加其生物量外，还能显著促进Cd、Cu、Zn、Cr 在紫茉莉根部的积累[14]；内生菌摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)BGC XJ02能促进Cd超富集植物龙葵(SolanumnigrumL.)在不同Cd浓度条件下的生长和对P的吸收[15]。在Cd污染土壤上接种丛枝菌根真菌(Glomusmosseae)可促进黑麦草生长，增强其耐Cd性[16]；黑麦草和丛枝菌根真菌单一或联合应用均有利于缓解Cd对番茄生长的抑制[17]；抗Cd棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)可通过提升土壤pH值，降低土壤Cd生物有效性，分泌吲哚乙酸(IAA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶，增强黑麦草对Cd的抗性[18]。

用黑麦草修复Cd污染时，缓解Cd对种子萌发的毒害作用，提高其种子萌发期对Cd的耐性，对于保证或提升后期的修复效果比较关键。为此，本文以耐Cd真菌黑曲霉(Aspergillusniger)TL-F2菌株为研究对象，研究不同Cd浓度胁迫对TL-F2菌株分泌IAA、溶磷和产铁载体能力的影响，并用不同浓度的孢子液浸泡Cd胁迫条件下的黑麦草种子，研究其对黑麦草种子萌发和幼苗积累Cd的影响，旨在为利用该菌株强化黑麦草修复Cd污染提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株和植物

供试菌株系本实验室从矿区多种重金属污染土壤中筛选到的黑曲霉(Aspergillusniger)TL-F2菌株，由广州市微生物研究所鉴定[19]。采用PDA培养基28 ℃培养5 d后于4 ℃保藏备用。

供试植物为四倍体特高一年生黑麦草(冬牧70)，购自北京开元种业有限公司。

1.1.2 主要培养基和溶液

PDA培养基、黑曲霉液体培养基、无机磷培养基、亚利桑那菌琼脂(SA)培养基、铬天青S(CAS)检测液、Salkowski试剂、钼锑抗试剂等的配制参照文献[19-21]。所用试剂均为国产优级纯。培养基均在121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子液配制

将TL-F2菌株在PDA培养基平板上28 ℃培养5 d，然后用20 mL无菌0.9%(质量分数)NaCl溶液洗脱黑曲霉孢子，用血球计数板计数，分别调节孢子浓度至1×108mL-1和1×106mL-1。将制备好的孢子液置于4 ℃保存备用。

1.2.2 Cd胁迫下TL-F2菌株的促生特性试验

将浓度为1×108mL-1的TL-F2孢子液接种在含不同浓度(0、5、20、50 mg·L-1)Cd的培养基，28 ℃、150 r·min-1振荡培养7 d，检测其分泌IAA、溶磷和产铁载体的能力。

1.2.3 TL-F2菌株对Cd胁迫下黑麦草种子萌发的影响试验

设置不同Cd浓度(0、5、20、50 mg·L-1)和TL-F2孢子液浓度(0、1×106、1×108mL-1)，相互配合，共形成12个处理，每个处理设置3个平行样。选取颗粒饱满、大小均匀的黑麦草种子，用10%(体积分数)H2O2浸泡10 min后用无菌水彻底冲洗3～5次。然后，将黑麦草种子浸泡在不同浓度TL-F2孢子液中24 h。选取处理过的种子各50粒随机放入装有2层滤纸的培养皿(直径为12 cm)中，每皿加20 mL含不同浓度Cd的无菌水，28 ℃生化培养箱暗培养7 d。培养期间，自第3天起每日观察、记录种子的发芽情况，并基于称重法用无菌水补充蒸发的水分。幼苗收获后，分别测定根系、幼芽的长度和鲜重，及其Cd含量。

1.3 测定方法

1.3.1 促生特征测定

TL-F2菌株分泌IAA、溶磷和产铁载体的能力均采用分光光度法(UV 752型紫外-可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司)测定。

TL-F2菌株分泌IAA的能力采用Salkowski比色法[22]测定。取0.5 mL孢子液接入含不同浓度Cd和0.05%L-色氨酸的黑曲霉液体培养基，于28 ℃、150 r·min-1恒温摇床中振荡培养7 d。取发酵液至离心管，在4 ℃、6 000 ×g离心10 min。取2 mL上清液加入4 mL Salkowski试剂，摇匀后在25 ℃暗处放置30 min，测定D530值。

TL-F2菌株溶磷能力的测定采用钼锑抗显色法[23]。取0.5 mL孢子液接入含不同浓度Cd的无机磷液体培养基，于28 ℃、150 r·min-1恒温摇床中振荡培养7 d，同时设不接菌的处理作参比调0。将其在4 ℃、10 000 ×g离心15 min，然后取1 mL上层液体于50 mL容量瓶中，加入2，4-二硝基苯酚指示剂1～2滴，用10%(质量分数)氢氧化钠溶液或10%(体积分数)硫酸溶液调节至溶液刚呈微黄色，加入5 mL钼锑抗试剂，摇匀，加水定容，室温放置30 min，测定D720值。

TL-F2菌株产铁载体能力的测定采用CAS检验法[24]。吸取0.5 mL孢子液接入含不同浓度Cd的SA液体培养基，于28 ℃、150 r·min-1恒温摇床上振荡培养7 d，4 ℃、10 000×g离心15 min，把上层清液和CAS检测液以1∶1的体积比混匀，放置1 h后，测D630(A)，以SA液体培养基的D630为参比值(Ar)，计算TL-F2菌株产铁载体的能力(S，%)，其计算公式为S=[(Ar-A)/Ar]×100。

1.3.2 黑麦草种子萌发指标测定

分别以种子萌发3 d和7 d的发芽数占供试种子数的比例测算发芽势(GV)和发芽率(GR)。在每个培养皿中选择10株生长良好的黑麦草，用尺子人工测量其根长、芽长。去离子水冲洗干净后，滤纸吸干，称鲜重。然后，在105 ℃杀青10 min，65 ℃烘至恒重，称干重，剪碎备用。计算黑麦草种子的发芽指数(GI)、活力指数(VI)[25]、耐性系数(TI)[25]和胁迫指数(SI)[26]。

1.3.3 黑麦草根部和芽部Cd含量测定

精确称取1.3.2节中剪碎的植物样0.050 0 g，放入石墨消解管，加1 mL HClO4和9 mL浓HNO3，放置过夜(10～12 h)。在石墨消解仪中150 ℃持续消解至溶液澄清，将溶液转移、定容至50 mL，用0.22 μm滤头过滤，取滤液，用ZEEnit700P型原子吸收分光光度计(德国耶拿)测定Cd含量。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2016、SPSS 22.0软件进行分析与做图，对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，对有显著差异(P<0.05)的，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫对TL-F2菌株促生特性的影响

2.1.1 产IAA的能力

由图1可知，过高浓度(20、50 mg·L-1)的Cd胁迫会显著(P<0.05)抑制TL-F2分泌IAA，比对照组分别下降55.76%和65.69%；但低浓度的Cd对TL-F2菌株产IAA的能力无显著影响。

2.1.2 溶磷能力

由图2可知，过高浓度(20、50 mg·L-1)的Cd胁迫会显著(P<0.05)抑制TL-F2的溶磷能力，比对照组分别下降50.07%和78.19%；但低浓度的Cd对TL-F2菌株的溶磷能力无显著影响。

2.1.3 产铁载体的能力

由图3可知，Cd会显著(P<0.05)抑制TL-F2菌株产铁载体的能力，且抑制程度随Cd浓度的增大而呈上升趋势。当Cd浓度为5、20、50 mg·L-1时，其S值较CK分别减少48.18%、69.71%和80.08%。

2.2 TL-F2菌株对镉胁迫下黑麦草种子萌发的影响

不同Cd浓度下，TL-F2菌株对黑麦草种子萌发的影响如表1所示。整体来看，随Cd浓度增大，黑麦草种子的GV、GR、GI、VI和TI均呈下降趋势，但SI却呈上升趋势。当Cd浓度分别为0、5、20 mg·L-1时，接种低浓度(1×106mL-1)或高浓度(1×108mL-1)TL-F2菌株的黑麦草的GV、GR、GI较不接菌的处理无显著变化；但接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的VI较不接菌的处理显著(P<0.05)增加，且当Cd浓度为5、20 mg·L-1时，接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的TI亦较不接菌的处理显著(P<0.05)增加。当Cd浓度为5 mg·L-1时，接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的SI较不接菌的处理显著(P<0.05)降低。当Cd浓度为50 mg·L-1时，接种低浓度或高浓度TL-F2菌株的黑麦草的GR、GI、VI、TI和SI较不接菌的处理无显著变化，但接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的GV较不接菌的处理显著(P<0.05)增加。以上结果说明，在一定程度的Cd胁迫条件下，接种适当浓度的TL-F2菌株有助于促进黑麦草种子的萌发。

表1 不同浓度Cd胁迫下接种TL-F2菌株对黑麦草种子萌发的影响Table 1 Effects of different concentrations of Cd on ryegrass seed germination with inoculation of A.niger TL-F2

2.3 TL-F2菌株对镉胁迫下黑麦草幼苗生长的影响

不同浓度Cd胁迫下，A.nigerTL-F2对黑麦草幼苗生长的影响如表2所示。在种子萌发时期，种子生根易受Cd的抑制，当Cd浓度提高到50 mg·L-1时，所有处理的黑麦草在第3天后根系均不再继续生长，并慢慢退化，7 d后完全退化。整体来看，随着Cd浓度增加，黑麦草幼苗的根长、芽长均呈现下降趋势；但各处理下，黑麦草的根干重和芽干重并无显著变化。当Cd浓度为0时，接种低浓度或高浓度TL-F2菌株的黑麦草的根长、芽长较不接菌的处理无显著差异。当Cd浓度为5、20 mg·L-1时，接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的根长较不接菌的处理显著(P<0.05)增加，接种低浓度TL-F2菌株的黑麦草的根长较不接菌的处理无显著变化。当Cd浓度为5、20、50 mg·L-1时，接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草的芽长较不接菌的处理无显著变化，但接种低浓度TL-F2菌株的黑麦草的芽长却较不接菌的处理显著(P<0.05)减小。

表2 不同浓度Cd胁迫下接种TL-F2菌株对黑麦草生长的影响Table 2 Effects of different concentrations of Cd on ryegrass seedling growth with inoculation of A.niger TL-F2

2.4 TL-F2菌株对镉胁迫下黑麦草Cd含量的影响

TL-F2菌株对Cd胁迫下黑麦草地上部和根部Cd含量的影响如图4所示。高浓度(50 mg·L-1)Cd胁迫造成黑麦草根部在生长过程中退化。当Cd浓度为5、20 mg·L-1时，接种高浓度或低浓度的TL-F2菌株后，黑麦草地上部、根部的Cd含量较不接菌的处理无显著变化。当Cd浓度为50 mg·L-1时，接种高浓度TL-F2菌株的黑麦草地上部的Cd含量较其他处理显著(P<0.05)增加，但接种低浓度TL-F2菌株的黑麦草地上部的Cd含量较不接菌的处理无显著变化。

3 讨论

植物促生菌可通过不同的机制促进植物生长，并增强植物的抗逆性。大量研究证明，促生菌可分泌植物激素，如IAA和核黄素等，促进植物发芽、分蘖，促进根长等生物量的增加。促生菌还可产生植物调节物质，如ACC脱氨酶等，通过降低乙烯的含量，增强植物的抗逆性[27]。据报道，内生真菌A.nigerCSR3菌株在28 ℃、150 r·min-1的条件下恒温培养7 d，最高可产生(0.873±0.029)μg·mL-1的IAA[28]。Mesa等[29]报道，在Cu胁迫下BacillusaryabhattaiSMT50分泌IAA的含量下降了40%，这与本研究结果相似。本研究中，A.nigerTL-F2在Cd胁迫下分泌IAA的能力同样呈下降趋势，但仍有IAA产生，表明A.nigerTL-F2在Cd胁迫下仍具有促进植物生长的能力。Glick等[30]研究表明，促生菌可通过分泌IAA降低乙烯对植物的胁迫，从而在种子萌发期促进植物生根。在Cd污染土壤或水体中，植物因受到Cd富集的影响，对营养元素Fe和P的吸收会受到抑制，导致植物发育迟缓。研究表明，促生菌通过产生铁载体和溶磷可弥补由Cd在植物体内富集而引起的缺铁，促进植物对Fe和P的吸收[27]。铁载体不仅具有运输铁离子的作用，还可与多种重金属离子进行络合，形成稳定的络合物，降低环境中重金属离子的浓度。1952年，Johnston[31]首次研究了真菌的溶磷作用，发现A.niger的溶磷作用最强。A.nigerCSR3菌株具有产生铁载体的能力，与CAS的反应速率为3.8～5.6 mm·d-1[28]。非内生真菌A.nigerJ4在不同培养基中的溶磷量为6.50～17.23 g·kg-1，溶磷率为 26.11%～68.31%[32]。研究发现，木霉(Trichodermavirens)PDR-28菌株[33]、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)[34]和棘孢木霉(Trichodermaasperellum)[35]因具有产IAA、溶磷和产铁载体的能力，可改善重金属胁迫对植物的毒害作用，促进植物生长。本研究中，Cd胁迫下A.nigerTL-F2仍具有溶磷能力和产铁载体的能力，推测其也可促进根部生长和植物对Fe和P的吸收，缓解重金属胁迫。

种子萌发和幼苗生长是植物生命周期的开始，也是植物生命中最早接触外界环境、对外界做出应激反应的重要阶段，其中，发芽势和发芽率是衡量种子发芽能力的重要指标[36]。Cd污染可改变植物的形态结构和生理生化过程。长时间接触Cd后，植物根系呈黏胶状，腐烂，羽状数减少，根系伸长量减少，且侧根的形成会受到抑制[37]。张媛媛等[38]研究发现，随Cd浓度增加(≥20.0 mg·L-1)，黑麦草种子的GV、GR和GI都急剧下降，根鲜重和芽鲜重均有不同程度的降低。在本研究中，随Cd浓度增加，黑麦草的GV、GR、GI、VI、根长、芽长均表现出降低的趋势。这与Cd胁迫对火炬树种子萌发[39]和豇豆种子萌发[40]的影响一致。王涛等[41]发现，在不同浓度的Cd胁迫下，接种1×108mL-1聚多曲霉菌菌株能够提高芥菜的种子活力，促进种子萌发。本研究中，添加不同浓度的菌液对黑麦草种子萌发的影响不同，相对来说，高浓度(1×108mL-1)的A.nigerTL-F2菌液更有助于促进黑麦草的种子萌发和幼苗生长。这可能是由于高浓度菌液产生IAA、溶磷和产铁载体的能力更强，更有助于缓解Cd对黑麦草种子的抑制和毒害作用。种子生根极易受到Cd的抑制，当Cd浓度为50 mg·L-1时，黑麦草根系几乎不能持续生长，7 d完全退化。这可能是因为高浓度Cd胁迫已对黑麦草种子和初生幼苗造成了不可逆的损伤。受此影响，接种A.nigerTL-F2菌株对高浓度Cd胁迫下的黑麦草生长无明显促生效果。这与陆仲烟等[42]的研究结果一致：在较低浓度Cd胁迫下，接种伯克氏菌D54显著促进了水稻根系的生长，提高了种子的活力指数，但当镉浓度提高到100 mg·L-1后，水稻根系几乎没有生长。研究表明，高浓度Cd使得种子中淀粉酶和蛋白酶的活性受到抑制，植物细胞中DNA和RNA的活性降低，核酸含量下降，有丝分裂过程受阻，进而影响种子发芽和幼苗生长[25，43]。

Cd胁迫下，接种不同浓度菌液对黑麦草Cd含量的影响不同，当Cd浓度为50 mg·L-1时，接种高浓度A.nigerTL-F2显著提高了黑麦草地上部的Cd含量。这与史鼎鼎等[44]的结果一致：在不同浓度的重金属处理条件下，接种RhodococcusbaikonurensisJ6可促进黑麦草地上部Cd的积累，最高可达27%。接种铜绿假单胞菌、产碱杆菌和枯草芽孢杆菌的芥菜根和茎组织中重金属含量也相应增加[45]，但具体机理还不是很明确。这可能与促生菌分泌IAA、溶磷和产铁载体，增加植物抗逆性和生长能力相关。接种低浓度A.nigerTL-F2对黑麦草地上部和根部的Cd含量无明显影响。其原因可能是，低浓度Cd胁迫下黑麦草幼苗生长几乎不受影响，因而其Cd含量无变化。高浓度A.nigerTL-F2对黑麦草根部Cd含量无显著影响，可能是因为A.nigerTL-F2对Cd进行了吸附转化或沉淀，从而降低了Cd浓度，缓解了Cd对黑麦草的毒害；也可能是因为A.nigerTL-F2产生铁载体络合了部分Cd，降低了黑麦草根部对Cd的吸收。