3-氰基吡啶转烟酸菌株的筛选及发酵条件研究

金如昌，杨竞成，李玉山，夏伟

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽马鞍山243100）

烟酸（Nicotinic Acid）又称尼克酸，是一种水溶性维生素，属于维生素B族，广泛用于食品、药物合成和饲料添加剂等。烟酸在生物体内主要以辅酶I、辅酶II 的形式存在，可以增强细胞之间的新陈代谢反应，以抑制心血管疾病，同时也是抗糙皮病的重要因子。目前，市场上主要采用化学法生产烟酸，该方法通常需要高温、高压、强酸、强碱等，且产物回收纯化过程复杂，生产成本较高，容易对环境造成污染，不符合绿色化学发展方向。

随着生物技术的快速发展，生物催化生产烟酸已经取得了长足的进步。张淑蓉等用腈水解酶131催化3-氰基吡啶直接水解成烟酸，经过发酵优化，产物纯品收率达到了85%左右。周琼等从土壤中获得了一株具有3-氰基吡啶水解酶活性的菌株CCZU10-4，烟酸的产率达到了93.5%。利用腈水解酶作为生物催化剂生产烟酸，大大提升了产品纯度，且反应条件温和，对环境污染小，具有广阔的发展前景。目前国内报道能够产生腈水解酶菌株还较少，并且酶活较低，后续的发酵条件研究也较少。因此筛选出一株高腈水解酶菌株，对于生物法合成烟酸具有重要意义。

本研究从土壤中筛选出腈水解酶菌株NA-6，并对其菌株的培养及合成烟酸的条件进行了初步探究，为烟酸生产提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

烟酸菌株分离样品：筛选的土样采自安徽瑞邦生物科技有限公司实验室周围、生产车间周围、公司花园内以及公司周围。所有试剂为市购。

培养基配方：

富集培养基：3-氰基吡啶5 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；琼脂20 g；微量元素1 mL；蒸馏水补至1 L；pH 7.0。

种子培养基：葡萄糖10 g；3-氰基吡啶10 g；KHPO0.2 g；KHPO0.2 g；MgSO·7HO 0.2 g；NaCl 10 g；微量元素1 mL；琼脂20 g；蒸馏水补至1 L；pH 7.0。

筛选培养基：3-氰基吡啶10 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；微量元素1 mL；琼脂20 g；蒸馏水补至1 L；pH 7.0。

发酵培养基：葡萄糖10 g；可溶性淀粉40 g；3-氰基吡啶5 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；微量元素1 mL；蒸馏水补至1 L，pH 7.0。

微量元素：CuSO·5HO 0.06 g；FeCl0.18 g；CaCl0.18 g；MnSO0.15 g；ZnCl0.20 g；CoCl0.5 g ；蒸馏水补至1 L。

仪器：恒温摇床；超净工作台；紫外可见分光光度计等。

1.2 实验方法

产烟酸菌株的筛选：将土壤样品用蒸馏水稀释成1%的浓度接入到富集培养基中，28℃、200 rpm 充分振荡，富集培养三次，用生理盐水稀释成适宜的倍数，转入以3-氰基吡啶为唯一氮源的筛选培养基，3～4 d后，挑取单菌落于平板培养基培养，待长出菌落后，进行平板划线传代2～3 次，分离纯化菌株。纯化的菌株接种于20 mL 种子培养基中，28℃、200 rpm 振荡培养24 h，按5%的接种量接种于100 mL 的发酵培养基中，28℃、200 rpm 振荡培养4 天，采用Berthelot 法（苯酚-次氯酸盐光度法）测定腈水解酶酶活进行复筛。

发酵条件的优化：分别采用不同的发酵温度、培养基起始pH 值、不同的3-氰基吡啶浓度，经培养后测定发酵液酶活，找出最佳培养条件。

2 结果与讨论

2.1菌株筛选

通过富集培养、选择平板筛选、多次菌株纯化共初筛到腈水解酶菌株11 株。对初筛得到的菌株进行发酵培养，采用苯酚-次氯酸盐光度法测定发酵液酶活进行复筛，最终确定产烟酸菌株11 株，其中NA-6 酶活最高，达到了10.21 U/mL，该菌株来自生产车间周围土样（表1）。

表1 不同地点菌株酶活测定

2.2 菌株的形态鉴定

对酶活最高的菌株NA-6 进行形态鉴定，如图1 所示，该菌株的菌落形态较小，卵圆形，边缘光滑，乳白色，半透明，经初步鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），于2020 年6 月1 日提交至中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2020285。

图1 菌株的形态鉴定及简单染色

2.3 腈水解酶产酶发酵条件研究

以NA-6为实验菌株进行产酶条件的研究：

2.3.1 发酵培养基起始pH对酶活的影响

为了明确NA-6 产烟酸的最适pH，配制不同pH 值的发酵培养基，在28℃、200 rpm 振荡发酵培养24 h，测定腈水解酶活大小。结果表明：在pH值4.0～7.0时，酶活都是随着pH值的增大而增大；当pH值大于7.0时，酶活开始下降，pH值在7.0时，产酶最佳，见图2。

图2 起始pH对酶活的影响

2.3.2 发酵培养基温度对酶活的影响

分别选择在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下，200 rpm 振荡发酵培养24 h，然后测定腈水解酶活力大小。图3 表明，30℃时酶活最大，产酶量最高，24℃～30℃内，随温度升高，酶活能力增加。超过30℃时酶活开始下降，可能会引起菌体衰老，难以完成对原料的转化，所以确定最适的发酵温度为30℃。

图3 温度对酶活的影响

2.3.3 3-氰基吡啶浓度对酶活的影响

分别向发酵培养基中加入浓度为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的3-氰基吡啶，测定酶活，图4 结果表明，随着浓度的增加，酶活逐渐增加，当3-氰基吡啶浓度为0.3%时，酶活达到最大值，但随着浓度继续增加，酶活也开始下降，说明当3-氰基吡啶浓度达到一定时，再增加其浓度，可能会对细胞产生毒害作用，导致酶活下降。

图4 3-氰基吡啶浓度对酶活的影响

3 结论

（1）本实验利用富集培养技术，同时以3-氰基吡啶为唯一氮源，通过平板筛选、菌株纯化等从土壤中筛选出11株催化3-氰基吡啶水解为烟酸的产腈水解酶新菌株，其中NA-6 活性最高，酶活达到了10.21 U/mL，经初步形态鉴定该菌株为恶臭假单胞菌。

（2）对一株活性最高的菌株NA-6展开了发酵条件的优化研究，在初始pH 值为7，发酵温度30℃，3-氰基吡啶浓度0.3%时，酶活最大，比原始提高了1.89倍。