探针药物法评价不同羟基位点苯乙酸对4种肝微粒体酶的代谢影响

康 超，郝 督，简思杰，荣 娜，刘 祥*，丁 锐

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院 中德天然产物研究所， 陕西 汉中 723000；2.甘肃新希望六和农牧有限公司， 甘肃 兰州 730000)

3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯乙酸是3种重要的化工中间体，广泛用于医药、染料、农药等领域[1]。其中，4-羟基苯乙酸被认为是一种潜在的高渗、缺氧的抑制剂[2]，具有抗焦虑[3]、抑菌和防治肺水肿活性特性[4]。3-羟基苯乙酸和3,4-二羟基苯乙酸是神经递质的内源性代谢物[5]，经小鼠静脉注射后均表现出抗焦虑活性。细胞色素P450酶系是代谢内源性(激素)和外源性化合物(药物、农药)的混合功能氧化酶，是肝脏重要的Ⅰ相代谢酶系，引起人体一系列的药代动力学变化，负责90%药物的代谢和多种外源化合物的代谢，可用作药物之间相互作用的预测[6-8]。因此CYP450酶常用于药物代谢情况的评价。

本研究应用大鼠肝微粒体孵育法和Cocktail探针法，与美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)推荐的探针底物[9]非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睾酮在体外孵育后，利用液相色谱技术评价不同羟基位点苯乙酸对大鼠主要的CYP450酶系4种亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的体外抑制作用，以期探讨不同羟基位点苯乙酸的代谢差异，为新药合成奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验试剂

3-羟基苯乙酸(货号B24111)、4-羟基苯乙酸(货号B30104)和3,4-二羟基苯乙酸(货号B21788)，均为分析标准品，购于上海源叶生物科技公司，HPLC纯度≥98%；非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮(上海源叶生物科技公司，纯度≥98%)；还原辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH，批号S10103)、色谱甲醇、色谱乙腈(纯度≥99.5%)均购于天津市大茂化学试剂厂；改良型BCA测蛋白浓度试剂盒(上海生工有限公司)、冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪含自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机、低压四元梯度泵、DAD检测器(thermo)；Intersil® ODS-3(日本岛津)；ME104E/02型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；DW-86L388L超低温冷冻冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；1730R微量高速冷冻离心机(韩国基因有限公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；HH-2数显恒温水浴锅(常州润华电器有限公司)；全自动雪花制冰机(日本松下电器产业株式会社)；KQ3200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；涡旋振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；溶剂过滤器(天津市领航实验设备股份有限公司)。

1.3 实验动物

健康8周龄雄性SD大鼠3只，体重(200±10) g(西安交通大学实验动物中心，合格编号SCXK(陕)2018-001)，为SPF级动物。将大鼠饲养在22 ℃、湿度70%、12 h明暗交替环境下，允许自由进食和饮水，饲养5 d以上，保证充分适应环境。

2 实验方法

2.1 肝微粒体的制备及浓度测定

雄性SD大鼠，12 h明暗交替，实验环境下适应5 d以上。取样前12 h禁食不禁水，将大鼠脱颈处死，剖腹后摘取肝脏，用已预冷的生理盐水冲洗干净，用剪刀剪碎。称取肝脏组织，加入质量比为1∶9的生理盐水，3000 r/min冰浴匀浆20 s，4 ℃条件9000 r/min离心20 min，上清液转移至含0.2 mL CaCl2(88 mmol)溶液的离心管中，冰浴振摇5 min，27 000g离心20 min。在沉淀中加入400 μL甘油-Tris缓冲液，吹打混匀，于-80 ℃冰箱保存。用BCA法测定所制备的微粒体蛋白浓度，根据试剂盒说明书进行操作，OD562 nm下测定样品吸光度。以A562吸光值为纵坐标，BSA浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，计算所得肝微粒体蛋白浓度。

2.2 标准曲线的建立

精密称取甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、非那西丁、睾酮标准品11.4、9.2、10.4、9.3 mg，以色谱甲醇定容于10 mL容量瓶，涡旋混匀，配成1.14、0.92、1.04、0.93 mg/mL的标准储备液。配制4组质量浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00 μg/mL的标准溶液，0.22 μm有机微孔滤膜过滤后上HPLC，以探针底物浓度(μg/mL)为横坐标，不同浓度下所测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程。

2.3 实验分组及肝微粒体孵育体系

实验分3组进行，实验组(3-羟基苯乙酸组、4-羟基苯乙酸组、3,4-二羟基苯乙酸组)、空白对照组(无药物)和无活性组(无NADPH)，每组实验平行3样本。精密称取3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯乙酸标准品20.14、16.27、12.65 mg溶于甲醇配制浓度为1 mg/mL的母液。以Tirl-HCl(100 mmol/L，pH 7.4)为溶剂稀释，制得终浓度为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/mL的3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯乙酸溶液。如表1所示为孵育体系，体系在37 ℃恒温水浴中预孵育5 min后快速加入30 μL的NADPH溶液启动反应。30 min后立即加入500 μL冰冷甲醇溶液终止反应，4 ℃环境沉淀蛋白3 h，涡旋振荡1 min，14 000 r/min离心15 min，取上清液，20 μm有机滤膜过滤上清液上HPLC。

2.4 高效液相色谱检测方法

Intersil® ODS-3(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流速：0.75 mL/min；流动相：流动相(A)乙腈，流动相(B)25 mM乙酸钠缓冲液；检测波长范围：200～350 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；采用梯度洗脱，其程序如表2所示。

表1 大鼠肝微粒体孵育体系加样表

表2 流动相梯度洗脱程序

2.5 相对酶活性计算

通过建立的探针药物法检测物中探针底物的峰面积代入标准曲线中计算底物浓度(无活性组测定值为总底物浓度)代入公式计算相对酶活性：

相对酶活性=(总底物浓度-剩余底物浓度)/总底物浓度×100%。

2.6 数据处理

使用Excel、SPSS 22.0统计软件和GraphPad Prism 5.0进行数据的处理与分析，连续型变量采用均数±标准差(x±SD)进行统计学描述，实验组和空白组采用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 BCA法蛋白浓度测定

利用BCA法测定制备好的大鼠肝微粒体蛋白浓度，根据试剂盒说明书进行操作，在波长为562 nm处测定样品的吸光度。以BSA的浓度(mg/mL)为横坐标，A562吸光值为纵坐标，所得线性回归方程为y=0.001 4x+0.127 7，相关系数R2=0.995 6，其相关系数达到检测要求，计算获得大鼠肝微粒体蛋白浓度为0.4 mg/mL。

3.2 探针药物的标准曲线

以非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮样品的浓度为横坐标，各探针药物的峰面积为纵坐标，获得标准曲线，如表3所示。标准品的HPLC色谱图如图1所示，表明各物质峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，出峰时间分别为12.180、13.057、13.353、16.013 min，在浓度范围内，各探针药物峰面积与浓度均呈良好的线性关系。

表3 大鼠肝微粒体中CYP450酶探针底物的回归方程

A.非那西丁；B.氯唑沙宗；C.甲苯磺丁脲；D.睾酮 图1 各探针药物的色谱图

3.3 CYP450酶系代谢底物剩余浓度

将各组测定的峰面积带入标准曲线，得出各探针药物的底物剩余浓度，如表4—表6所示。

表4 3-羟基苯乙酸存在下大鼠肝微粒体中CYP450酶底物的剩余浓度(x±SD，n=3)

表5 4-羟基苯乙酸存在下大鼠肝微粒体中CYP450酶底物的剩余浓度(x±SD，n=3)

表6 3,4-二羟基苯乙酸存在下大鼠肝微粒体中CYP450酶底物的剩余浓度(x±SD，n=3)

3.4 CYP450酶系的相对活性

计算各组药物的相对酶活性，结果如表7—表9所示。由表中数据得出3-羟基位点苯乙酸在中高浓度时，大鼠肝微粒体中的CYP1A2、CYP2E1和CYP2C9的酶活性相对于空白组有显著性差异；其浓度在50 μg/mL时，肝微粒体CYP3A4的酶活性有显著性差异。4-羟基苯乙酸在不同浓度时肝微粒体CYP2C9的酶活性有显著差异，在高浓度CYP2E1和低浓度CYP3A4的酶活性有显著性差异。3,4-二羟基苯乙酸在不同浓度时，肝微粒体CYP2C9和CYP2E1的酶活性有显著差异；在高浓度时，肝微粒体CYP3A4有显著性差异；在低浓度时，肝微粒体CYP1A2和CYP3A4的酶活性有显著差异。

3.5 探针底物的IC50值及抑制曲线

利用GraphPad Prism 5.0软件，以相对酶活性为纵坐标，以不同羟基位点苯乙酸浓度的对数值(lgC)为横坐标作图，得到不同羟基位点苯乙酸对CYP450酶系不同亚型的抑制曲线，如图2—图4所示。结果显示：随着3-羟基苯乙酸浓度的逐渐升高，CYP2E1与CYP3A4的酶活性均有上升趋势，在浓度达到50 μg/mL后，酶活性到达最大值，随后酶活性逐渐降低。4-羟基苯乙酸浓度逐渐增大时，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性变化趋势大致相同，在浓度达到100 μg/mL时，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性均到达最大值，而CYP3A4则是在4-羟基苯乙酸浓度达到20 μg/mL时，酶活性到达最高值；3,4-二羟基苯乙酸的浓度为10 μg/mL时，4种CYP亚型酶的酶活性均达到最大。

表7 3-羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体CYP亚型酶相对活性的影响(x±SD，n=3)

表8 4-羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体CYP亚型酶相对活性的影响(x±SD，n=3)

表9 3,4-二羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体CYP亚型酶相对活性的影响(x±SD，n=3)

图2 3-羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体中 CYP各亚型酶活性的抑制曲线

通过抑制曲线计算酶活性的IC50值，根据通用的CYP450酶抑制剂强度分级规则进行分析[10]，表10结果显示IC50值均大于100，即不同羟基位点苯乙酸对大鼠肝细胞色素P450(CYP450)酶4种亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4均无显著抑制作用。但3,4-二羟基苯乙酸对考察的CYP450酶系的4种亚型的IC50值比只有单个羟基位点的3-羟基苯乙酸和4-羟基苯乙酸的数值更小，表明3,4-二羟基苯乙酸对4种CYP亚型酶的抑制趋势较明显。

图3 4-羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体中 图4 3,4-二羟基苯乙酸对大鼠肝微粒体中 CYP各亚型酶活性的抑制曲线 CYP各亚型酶活性的抑制曲线

表10 不同羟基位点苯乙酸组对大鼠肝微粒体各亚型的IC50值

4 讨论

近年来，关于药物单体对于CYP450酶系的代谢研究较常见，但是有关于药物中间体的报导很少。具有羟基位点的苯乙酸作为一种精细化工中间体，因其自身的特殊结构显示出抗焦虑和肝保护[11]的生理活性，并可用于合成多种药物，但它的代谢情况并不清楚。CYP450是药物代谢主要酶系，药物在代谢过程中会对CYP450的酶活性产生影响，因此可通过检测CYP450酶活性变化来探究药物的代谢情况。CYP450酶更可参与到中药诱导肝毒性的检测之中，其活性变化可直接用作中药毒副作用的参考[12]。本实验发现，当3-羟基苯乙酸的浓度逐渐升高时，CYP2E1和CYP3A4的活性均有上调，随后下降。4-羟基苯乙酸与3,4-二羟基乙酸在随着药物的浓度升高，4种肝药酶的总体活性上升趋势较为明显，其中CYP3A4升高趋势表现一致。3种不同羟基位点的医药中间体，是同分异构体，因此在肝微粒体蛋白的活性曲线具有相似性，可能与其本身的结构相关。黄彧等[13]对厚朴酚、和厚朴酚(同分异构体)在大鼠肝微粒体中的抑制作用研究中发现，两者对大鼠肝微粒体中的4种亚型酶(CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP2B6)活性均有抑制作用，且随化合物浓度和预温育时间增加而增加。本研究在相同视角下，表明3种不同羟基位点的医药中间体，在与这4种酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4)代谢的药物进行联用时，不存在相互作用，可为临床药物使用提供理论依据。

HPLC法操作方便，检测结果准确，灵敏度高且成本低。李清等[14]利用HPLC检测探针底物浓度来评价中药对肝微粒体CYP450酶活性的影响。本实验通过HPLC方法对4种CYP450亚型酶的探针底物进行检测，间接获得了不同位点的羟基苯乙酸对CYP450亚型酶的影响。探针药物作为CYP450酶的底物，广泛用于检测CYP450酶的活性，间接反映药物在体内的代谢情况。目前，较为成熟的探针药物有氯唑沙宗、右美沙芬、睾酮、甲苯黄丁脲和奥美拉唑，对应CYP450酶分别为CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19。Liu等[15]和景娴等[16]通过检测氯唑沙宗和右美沙芬的底物浓度，分析了CYP2E1和CYP2D6的活性，从而评价抗生素联用在体内引起的肝损伤机理。肝微粒体是研究细胞色素P450(CYP450)酶介导的药物代谢的理想培养基[17]，肝微粒体含有肝脏表达中所有参与药物代谢的CYP450酶系，且制备简单，可长期保存，代谢时间短，结果重现性好，方便大量操作，该法普遍应用于评价药物代谢[18]。郭艳丽等[19]及张培玉等[20]利用鼠或人肝微粒体模型，研究了中药成分对CYP450酶系的影响。

本研究制备了浓度为0.4 mg/mL大鼠肝微粒体开展药物代谢情况研究，发现不同羟基位点苯乙酸均对大鼠肝微粒体的CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A无抑制作用，药物安全性高，为不同羟基位点苯乙酸药物开发奠定基础，但存在种属差异性，人源肝微粒的代谢还需进一步研究探讨。