HPLC加标检测6－氨基青霉烷酸产品中残余苯乙酸含量

王海雁，常华，胡雅琴，杨维芳，冯锋

（1.山西大同大学 化学化工学院，山西 大同 037009；2.国药集团大同威奇达中抗制药有限公司，山西大同经济技术开发区，山西 大同 037000）

0 引言

我国是世界青霉素原料药生产大国，山西大同地区由于其得天独厚的日照时间长、空气干燥等气候条件，成为全国主要的青霉素原料药生产基地.6－氨基青霉烷酸（6－Aminopenicillanic acid，6－APA），结构式见图1A，是制备半合成头孢菌素如氨苄青霉素、阿莫西林、羟氨苄青霉素、唑酮氨苄青霉素、硫苯咪唑青霉素、磺唑氨苄青霉素等的主要母核.6－APA终产品中苯乙酸（结构式见图1B）的含量是评价6－APA品质的一个重要标准.6－APA终产品中苯乙酸的质量百分比必须低于0.1%，否则直接影响下游产品质量.目前已有的苯乙酸的分析方法，主要是针对6－APA生产过程中的质量控制，终产品中苯乙酸等杂质的单独测定则需要复杂的样品前处理过程［1－6］.

基于《中国药典》2010年版检测6－APA的标准HPLC方法［7］，本实验建立了HPLC的苯乙酸加标检测法，能够直接测定6－APA终产品中的6－APA及残留苯乙酸的含量.该方法符合国家食品药品监督管理局国家药品标准［8］，且不需要柱前预处理.与现行梯度洗脱测定苯乙酸含量的方法相比，操作简便、快速，且精密度、准确度、重复性均符合国标要求.

图1 6－APA、苯乙酸的结构式Fig.1 Constitutional formulas of 6－APA and Phenylacetic Acid

1 实验方法

1.1 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国），紫外分光光度计（岛津UV－1601，日本），100mm×4.6mm，5μm ODS－2C18色谱柱（Hypersil，美国）.

KH2PO4（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），Na2HPO4（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），6－APA终产品（批号1205179，含水分0.043%，国药集团大同威奇达药业中抗有限公司提供），6－APA标准品（批号 WS2012001，含量99.4%），苯乙酸标准品（批号 WS2012002，含量99.19%），实验用水均为纯化水.

1.2 实验方法

在2010年版检测6－APA的标准HPLC方法［7］基础上结合本实验室条件加以优化.流动相A为pH＝7.00的磷酸盐缓冲溶液，流动相B为乙腈.检测波长选择220nm，柱温是25℃，流量为1mL／min，进样量为20μL.

依据6－APA样品中苯乙酸色谱峰的保留时间和峰面积定量计算苯乙酸的含量.为了精确鉴别色谱图中微量苯乙酸的出峰位置，参照文献中检测物加标分析法［8］，将已知浓度的苯乙酸标准液在测试前加入到样品溶液中一同进样，与未加标准品的样品溶液的色谱图相比较，该色谱图中苯乙酸的峰面积会明显增加，即可精确确认实际样品中苯乙酸峰的位置，并根据标准曲线计算其含量.这是一种简单快速的定量定位法.

精确称量苯乙酸标准品、6－APA标准品适量，用流动相A溶解并稀释.配制苯乙酸标准储备液的浓度为0.1526mg／mL，苯乙酸标准对照液浓度为其标准储备液质量浓度的1%，用于精密度试验的苯乙酸标准使用液浓度为2.250×10－3mg／mL；配制6－APA标准储备液的浓度为3.00mg／mL，6－APA标准对照液的浓度为其标准储备液浓度的1%.配制苯乙酸和6－APA混合标准对照液中苯乙酸与6－APA的浓度与其标准对照液相同，分别为1.526×10－3mg／mL、3.00×10－2mg／mL.4℃条件下贮藏.

2 结果与讨论

2.1 系统适用性实验

分别取空白辅料溶液、苯乙酸标准对照液、6－APA标准对照液、苯乙酸和6－APA混合标准对照液，以及6－APA终产品作为供试品溶液，按以上条件测定.得到6－APA和苯乙酸的保留时间分别为3.886min和6.372min（图2）.苯乙酸和6－APA分离完全，分离度为10.05，大于1.5；6－APA的理论塔板数为4793，不低于1500，拖尾因子为0.86，不高于2.5，符合国标［9］.

图2 苯乙酸和6－氨基青霉烷酸混合标准对照液的色谱图Fig.2 Chromatograms of standard solution of 6－aminopenicillanic acid and phenvacetic acid

2.2 线性范围

以峰面积A为纵坐标，苯乙酸的浓度C为横坐标进行线性分析，得到苯乙酸对照标准品溶液在0.3022～3.022×10－3mg／mL浓度范围内其浓度C与峰面积A 呈良好的线性关系，线性方程Y＝38.74 X＋0.2637，相关系数为0.9998.

2.3 检测限及精密度实验

流动相A逐级稀释苯乙酸标准对照品溶液10倍、100倍、1000倍、10000倍.分别过滤，注入Agilent样品瓶中，按色谱条件测定，记录色谱图，量取峰面积.结果表明：当信噪比（S／N）为3／1时，溶液的浓度为0.0153×10－3mg／mL，苯乙酸对照品溶液的检测限为15.26ng／mL（RSD＝0.82%）.

苯乙酸标准使用液注入Agilent样品瓶中，按色谱条件测定，记录色谱图，量取峰面积，连续进样6次.该试验得出6次进样所得峰面积的相对标准偏差为0.82%，小于2.0%，可用于6－APA样品中苯乙酸含量的测定.

2.4 稳定性实验

过滤苯乙酸标准对照液，注入Agilent样品瓶中，分别于0h，1h，2h，3h，4h，5h进样.按色谱条件测定，记录色谱图，量取峰面积.稳定性实验结果RSD＜2%，表明本实验条件下，样品在25℃条件下5h内稳定，仪器的稳定性良好，可以满足6－APA样品中苯乙酸含量的测定［9］.

2.5 加标苯乙酸的回收率实验

取3批苯乙酸含量已知的6－APA样品，如表1所示精确称取样品量，置于100mL的容量瓶中，并平行加入1.0mL苯乙酸储备液，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀、过滤，取滤液，注入Agilent样品瓶中，按色谱条件进行测定.测定结果见表1.实验结果显示，实验回收率在80%～120%范围内，可以满足6－APA样品中苯乙酸含量的测定［9］.

2.6 终产品样品分析

实际样品分析时，按照试验方法对不同批号的6－APA终产品样品进行加标处理并测定.结果见表2.样品分析结果表明，由该方法测得的样品中苯乙酸的含量略小于由梯度洗脱测得的结果，但均符合国家食品药品监督管理局国家药品标准（0.1%）.

表1 苯乙酸回收实验Table 1 Recovery test of standard Phenethyl acid

表2 终产品中苯乙酸测定Table 2 Analysisi of phenethyl acid in real samples

3 结论

本文建立了高效液相色谱法加苯乙酸标准品检测6－APA样品中残留苯乙酸含量的方法.应用本方法，6－APA、苯乙酸分离完全，线性良好，相关系数为0.9998.对样品不需要进行柱前预处理，不仅节省了时间，提高了效率，而且所得的测量结果，准确度与精密度都符合要求，分析结果令人满意.总体来说，本文所用方法快速便捷，而且准确度、分离度、重现性都能达到要求，完全适用于终产品中6－APA和残留苯乙酸含量的直接测定.

［1］赵静玫，都绛瑛，张铭俊.青霉素裂解液的高效液相色谱分析［J］.色谱，2001，19（1）：88－90.

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［6］师学娟，苏大伟，刘焕姿，等.高效液相色谱法测定6－APA 的相关物质［J］.河北化工，2011，34（12）：20－22.

［7］《中国药典》2010年版二部附录 Ⅳ［S］.

［8］Wang H Y，Lee W M A，Shuang S M，et al.SPE／HPLC／UV Studies on Acrylamide in Deep－fried Flour－based Indigenous Chinese Foods［J］.Microchemical Journal，2008，89：90－97.

［9］国家食品药品监督管理局国家药品标准 WSI－（X－046）－2005Z［S］.