硫化氢对拟南芥在干旱胁迫条件下的生理影响

金竹萍，方慧慧，张丽萍，罗雅楠，乔增杰，龚泽华，裴雁曦＊

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.中北大学 化工与环境学院，山西 太原 030051）

硫化氢（H2S）在常温下是一种无色有臭鸡蛋气味的气体，长期以来一直被科学家们当成有毒气体看待，认为它对人体有害无益.直到2008年杨广东等在Science发表论文，表明H2S参与了生理性血管扩张和血压的调节，将H2S的研究推向一个高峰［1］.之后越来越多的证据表明H2S在动物体中是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的又一种气体信号分子［2－3］.

植物体的内源H2S主要以L／D－半胱氨酸为底物，通过半胱氨酸脱巯基酶催化产生H2S、丙酮酸盐和NH3；也可以通过叶片吸收大气中的H2S；或者在亚硫酸盐还原酶的作用下，将SO2－3直接还原成H2S［4］.植物中已经克隆到与内源H2S产生直接相关的基因：L型半胱氨酸脱巯基酶编码基因（L－cysteine desulphydrase，LCD）At3g62130［5］和D型半胱氨酸脱巯基酶编码基因（D－cysteine desulphydrase，DCD）At1g48420［6］.H2S在植物体内生理作用的研究刚刚起步，相继有报道证实H2S可增强植物的抗氧化胁迫能力，增加植物非生物胁迫抗性［7－10］、促进根的形成和种子的萌发等［11－12］.目前绝大多数研究停留在外源施加H2S供体后，对供试材料进行表型观察和生理生化指标测定，而对内源H2S在植物体内重要生理作用的机制却知之甚少.

本文通过聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫，以拟南芥野生型和H2S产生酶的编码基因LCD的缺失突变体为实验材料，通过对胁迫前后种子萌发率和抗氧化酶等活性的测定，揭示了内源H2S对拟南芥（Arabidopsis thaliana）在干旱胁迫条件下的生理影响.

1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥生态型Columbia；购买美国俄亥俄州立大学（ABRC）的T－DNA插入突变体lcd（SALK＿082099）种子，经分子鉴定，杂合植株自交获得纯合株系.

1.2 实验方法

PEG处理参考张依章等的方法［13］，按照预实验结果，质量浓度（g／mL）梯度设定为0、0.1、0.15、0.17、0.19、0.25、0.3.播种消毒后的野生型（wild type，WT）种子，200粒／皿，每个PEG浓度梯度重复3次.置于人工气候箱内，（23±1）℃，光照强度2000lx，16h光照／8h黑暗周期培养.1周后记录种子的萌发情况，统计萌发率.萌发率

将种子萌发率为50%的PEG浓度作为种子萌发的半抑制浓度.在半抑制浓度的培养基上同时播种WT和lcd种子，培养1周后统计萌发率进行比较.

将1／2MS培养基上生长2周的WT和lcd幼苗取出并分为两部分：一部分进行H2S产率测定和材料脱水处理［7］，

另一部分幼苗的根部浸泡于0.3g／mL PEG溶液中5h，分别将胁迫前后的材料用50mmol／L Tris－HCl缓冲液（pH 7.8）提取粗蛋白.超氧化物歧化酶SOD活性采用A001－1试剂盒（南京建成生物公司）测定；过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD、抗坏血酸过氧化物酶APX的活性及丙二醛MDA含量测定参考李忠光等的方法［14］；过氧化氢 H2O2的测定方法采用DAB显色法［15］.

1.3 统计分析

结果用“平均值±标准偏差”表示，采用SPSS Statistics 17.0分析软件进行单因素比较，P＜0.05和P＜0.01分别为差异显著和差异极显著.

2 结果与分析

2.1 PEG干旱胁迫下WT和lcd的种子萌发

选取状态一致的WT种子，在上述不同PEG浓度条件下培养1周，统计萌发率.结果显示：对照组的萌发率为100%，随着PEG浓度的升高，萌发率逐渐降低.PEG浓度为0.17g／mL时，萌发率降低为50%，是拟南芥WT种子萌发的半抑制浓度；当PEG浓度增加到0.25g／mL时，WT种子的萌发受到完全抑制.以0.17g／mL PEG为培养浓度，同时播种Col和lcd种子，1周后再观察其萌发情况，结果如图1（a）所示.WT的萌发率大约为50%，lcd种子萌发率与之相比下降约40%，两者的差异极显著（P＜0.01）.

图1 WT和lcd的H2S产率（b）、失水率（c）及其在干旱胁迫下的种子萌发率（a）Fig.1 H2S production rate（b），water loss rate（c）and germination rate（a）of WT and lcd under drought stress

2.2 WT和lcd的H2S产率和失水率

为探究萌发率差异的原因，对两种材料的H2S产率和失水率进行了测定.突变体lcd的H2S产率仅为WT的61.86%，两者存在显著差异（P＜0.05）（图1b）；随着脱水时间的延长，lcd的失水速度明显较 WT快（图1c），且表现为更严重的萎蔫状态.为了进一步揭示内源H2S对植物体在干旱胁迫下的作用机制，测定以下相关的生理指标.

2.3 H2S对干旱胁迫下拟南芥体内H2O2的影响

H2O2是对植物体具有极强毒害作用的活性氧，几乎能氧化所有的细胞组分.采用DAB显色法来显示叶片中H2O2的含量，结果如P116图2（a）所示.胁迫前的野生型WT叶片中几乎没有H2O2，而突变体lcd叶片内H2O2较多.PEG干旱胁迫后，WT和lcd叶片中的H2O2斑点数量明显增加，尤其是lcd中的斑点更密集、颜色更深.

2.4 H2S对干旱胁迫下拟南芥体内MDA的影响

MDA含量可以反映植物膜脂过氧化的水平和对细胞膜的伤害程度.图2（b）所示是野生型WT和突变体lcd在PEG处理后体内MDA含量的变化情况.可以看出，在PEG胁迫前，WT体内MDA含量为lcd的80%，但没有显著差异（P＞0.05）.经过PEG胁迫处理后，WT和lcd体内MDA含量均增加，且两者相差1.56倍，差异极显著（P＜0.01）.

2.5 H2S对干旱胁迫下拟南芥POD活性的影响

POD是植物体内普遍存在的、活性较高的酶，通过POD活性可以了解某一时期植物体内生理代谢的变化.由图2（c）得知，胁迫前野生型 WT的POD活性与突变体lcd相比，没有显著差异（P＞0.05）.随着PEG的胁迫，其活性在二者体内均有明显的升高，WT在胁迫处理后POD活性提高了28.64%；而lcd则比处理前相比提高了2.11倍，与胁迫后的WT相比具极显著差异（P＜0.01）.

2.6 H2S对干旱胁迫下拟南芥CAT活性的影响

CAT在活性氧（ROS）代谢过程中，将H2O2转化为H2O和O2，使生物机体免受H2O2的毒害作用.由图2（d）可知，在正常培养条件下，野生型WT体内CAT的活性较低，突变体lcd与其相比具有显著差异（P＜0.05）.经过PEG胁迫后，lcd的CAT活性为胁迫前的1.84倍，差异极显著（P＜0.01），且与 WT相比也有极显著增加（P＜0.01）.

2.7 H2S对干旱胁迫下拟南芥SOD活性的影响

SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成H2O2，然后再进一步被CAT转化.因此SOD可看作是植物抗氧化的第一道防线.从图2（e）可以看出，PEG胁迫前野生型WT的SOD活性与突变体lcd相比，没有显著差异（P＞0.05）.PEG胁迫处理后，WT和lcd的SOD活性分别提高了1.26倍和2.22倍，且两者之间具有极显著差异（P＜0.01）.

2.8 H2S对干旱胁迫下拟南芥APX活性的影响

APX在ROS代谢过程中，以还原型抗坏血酸为底物对H2O2进行清除，使脂质过氧化作用减弱.从图2（f）可以看出，胁迫前的突变体lcd与野生型 WT相比，APX活性无显著差异（P＞0.05）.经过PEG进行胁迫之后，WT和lcd的APX活性均有极显著增加（P＜0.01），分别为胁迫前的1.23倍和1.37倍，且胁迫后的WT和lcd的APX活性相比差异显著（P＜0.05）.

3 讨论

H2S作为重要的气体信号分子，在植物生命活动中的作用已受到越来越多的关注.随着研究的不断深入，外源H2S对植物体的生理作用表现得更加全面.张华等研究了H2S供体NaHS对Cd和Cu胁迫下小麦种子萌发的影响，说明外源H2S能显著促进小麦种子中淀粉酶与酯酶的活性上升［12，16］.本研究以拟南芥野生型和H2S体内生成的关键酶编码基因LCD敲除突变体为实验材料，测定了PEG干旱胁迫后的种子萌发率.结果表明突变体lcd中由于LCD基因表达量下降，植株体内H2S的产率降低，使得其种子萌发率较WT降低40%，具有极显著差异（P＜0.01），进一步揭示了内源H2S可促进植物种子萌发的作用机制.

图2 WT和lcd在PEG胁迫下H2O2、MDA含量及各种抗氧化酶活性的比较Fig.2 Comparison of H2O2，MDA content and antioxidant enzymes activity under drought stress

此外，陆续有报道表明，外源H2S可作为一种抗氧化信号分子，提高植物的抗旱性［7－9］、缓解铬和铜等重金属毒性［10，12］.植物处在干旱和重金属等非生物胁迫的环境中时，会直接或间接地产生活性氧（ROS）［17］，对植物产生毒害作用.植物体在长期适应环境的过程中，进化出一套完整的酶促保卫系统，包括SOD、POD、CAT和APX等，能够清除大量自由基，从而降低或消除ROS对脂膜的伤害.有研究结果表明，在干旱、重金属等非生物胁迫条件下，外源施加H2S供体可使抗氧化酶的活性升高，MDA和H2O2的含量下降［9－10，12］.本实验结果表明：WT和lcd在PEG胁迫处理前，H2O2的斑点密度和颜色及略高的MDA含量，表明突变体lcd已有H2O2的积累，但大部分抗氧化酶的活性都未呈现显著差异；而经PEG胁迫处理后，H2O2的积累量和MDA含量极显著增加，SOD、POD和CAT活性较处理前均有不同幅度的增加，而且lcd与WT相比也有极显著差异（P＜0.01）.也就是说，正常生长条件下，WT和lcd中的H2O2含量无显著差异，因此两者的抗氧化酶活性差异不显著（P＞0.05）.经PEG胁迫处理后，由于H2S信号的缺失，使得lcd中H2O2的含量增加，氧化损伤的程度更为严重，植物通过提高抗氧化酶活性，达到清除ROS的目的.因此在干旱胁迫条件下，H2S对ROS的清除有促进作用，可能与植物体内的抗氧化系统是平行关系，两者共同作用最终清除ROS.这与外源NO可以使重金属As胁迫下的水稻抗氧化酶活性下降的结果相一致［18］.

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