聚羟基丁酸羟基辛酸关节一体化组织工程支架制备条件及性能优化

杜美丽，张永红，吕利华，刘坚，陈学英，赵良启＊

（1.山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；2山西医科大学 第二医院骨科，山西 太原 030001；3山西省医用组织库，山西 太原 030006）

创伤和骨性关节炎引起的关节骨软骨损伤是临床上的一种常见病，但由于软骨自身修复能力极弱，使得关节骨软骨损伤修复成为医学难题之一［1－2］.传统的关节骨软骨损伤治疗方法虽然取得了一些临床效果，但分别呈现出不同的医学缺陷与不足，如供体不足、供区继发性受损、免疫排斥等，长期疗效不够理想［3］.1994年Vacanti等［4］首次将组织工程学引入关节骨软骨损伤修复研究，为关节损伤修复开辟了新途径.关节骨软骨组织工程研究包括支架、生长因子和种子细胞三大部分，其中支架制备是最重要的基础工作之一.制备支架曾经历了单层支架、双层支架研究阶段.初期是分别制备软骨、硬骨单层支架，通过缝合／黏合组成两层关节支架.这种关节支架的缺陷是两层连接不紧密，容易分离或脱落.于是人们开始研究一次制备骨软骨双层支架，较好地解决了双层分离的问题，但未能解决阻止血管进入软骨部分的问题.为此，参照关节组织结构，研制仿生多层一体化关节组织工程支架成为新课题.

本实验室自主开发出一种新型生物材料——羟基丁酸与羟基辛酸共聚体［P（HB－HO）］，该材料具有良好的可塑性、加工性、生物相容性、生物可降解性和降解产物无毒性等特性［5］.本文通过溶剂浇铸／颗粒沥滤法［6－7］技术路线，以PHBHOx为连续相，研制骨层、过渡层、软骨层一体化仿生关节组织工程支架，优化支架制备条件和支架性能，并进行支架与细胞的复合培养试验，为该一体化支架修复关节损伤研究提供技术支撑与实验数据.

1 材料与方法

1.1 材料：羟基丁酸与羟基辛酸共聚体（山西大学生物技术研究所）、一周龄新西兰白兔（购自山西医科大学）、猪骨头（购自太原市田和食品集团有限公司）

1.2 主要仪器：RGT1－20A万能力学试验机（深圳瑞格尔仪器有限公司），JSM－6701F扫描电子显微镜（日本电子株式会社），酶联标记检测仪（美国BioRad－550型）.

1.3 实验方法

1.3.1 猪膝关节软骨脱细胞基质的制备

为了制备软骨层复合材料，参照改良的Courtman法［8］对关节软骨行脱细胞处理后，进行HE、甲苯胺蓝、Masson染色.

1.3.2 软骨层／过渡层／硬骨层一体化关节支架制备条件优化

各层支架的制备：氯仿溶液溶解PHBHOx及复合材料（脱细胞基质、β－磷酸三钙），加入一定粒径NaCl颗粒作为致孔剂充分混匀，置于自制模具内，压实常温干燥后脱模，蒸馏水浸泡去除NaCl，真空干燥至恒质量.

一体化支架的制备：选择各层支架的最优参数，以PHBHOx为连续相，氯仿为溶剂，在同一模具内连续制作3层支架，常温压实干燥后，脱模去盐制得软骨层／过渡层／骨层PHBHOx一体化关节组织工程支架.

1.3.2.1 孔隙率的测定：采用比重法［9］，在25℃条件下进行孔隙率测定.

1.3.2.2 力学强度的测定：万能材料试验机测试支架的抗压强度，支架为直径10mm、高度15mm的圆柱状.测试时以5mm／min加载速率进行，测定受力压缩达30%时的荷载，计算抗压强度.计算公式：

其中бc、P、A分别代表抗压强度（Pa）、压缩30%时的荷载（N）及试样面积（m2）.

1.3.2.3 扫描电镜观察：将支架切成6mm×3mm×3mm的长方体，真空喷金后，观察支架的内部结构以及孔径大小.

1.3.2.4 吸水率的测定：将支架切成质量大体相同的6块并称重记为m0，然后将其放在PBS缓冲液中，每隔1h用滤纸吸干称重记为m1.计算公式为

1.3.3 兔骨髓间充质干细胞与关节一体化支架的复合培养

将兔骨髓间充质干细胞（BMSC）与关节一体化支架进行复合培养，检测支架对BMSC生长和增殖的影响.

1.3.3.1 BMSC的分离：采用全骨髓分离法［10］提取并分离BMSC，接种于培养瓶，在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱进行原代培养，首次24h换含体积分数20%胎牛血清的L－DMEM液，以后每隔3d换液.

1.3.3.2 BMSC在支架上的生长情况：取第二代BMSCs，质量浓度0.25%的胰酶消化后调整浓度至1.0×103个／mL，在96孔板内放置20块相同规格的经消毒过的支架，将细胞悬液用移液枪滴注于支架上，每块材料接种150μL.在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱内静置4h后，每孔加入培养液200μL充分覆盖材料，作为实验组.将细胞以1.0×103／mL直接接种于96孔板内作为对照组.培养10d后经MTT法处理后在酶联免疫分析仪测定490nm处的OD值.所测数据进行t检测统计分析.

1.3.3.3 细胞在支架上的黏附情况：将支架切成体积大小相似的小块并用体积分数75%酒精浸泡24h，再用L－DMEM浸泡12h，在超净台上紫外线照射30min，然后将细胞滴加在支架上复合培养7d，用体积分数2.5%的戊二醛固定24h，体积分数10%、30%、50%、70%、90%的酒精梯度脱水，自然晾干后真空喷金，扫描电镜观察细胞在支架上的黏附情况.

2 结果

2.1 猪膝关节软骨脱细胞基质的制备结果

将脱细胞基质（ACTM）石蜡包埋、切片、倒置显微镜观察，结果见图1（P110）.经HE染色，细胞中空，无细胞核残留，只有细胞外基质（红色）（图1a）.经甲苯胺蓝染色，细胞外基质呈深蓝色，表明蛋白多糖呈阳性（图1b）.经Masson染色，细胞外基质呈蓝色，表明胶原呈阳性（图1c）.结果显示：猪软骨细胞已去除干净，仅保留了细胞外基质成分，表明该脱细胞基质不会引起免疫排斥反应，可用于BMSC培养.

2.2 支架各层支架制备条件优化及关节一体化支架制备结果

以孔隙率和力学强度为主要技术指标，进行了单因素优化试验，结果见表1（P110）.结果显示，致孔剂的粒径和含量分别影响着支架的孔径大小、孔隙率及力学强度，支架的孔隙率与NaCl含量成正比，力学强度与NaCl含量及β－TCP、ACTM含量成反比.根据人体骨软骨组织工程对各层的要求：软骨层选择ACTM／PHBHOx质量分数为4%、NaCl／PHBHOx为4g／g；过渡层选择 NaCl／PHBHOx为3g／g；硬骨层选择β－TCP／PHBHOx质量分数为15%、NaCl／PHBHOx为4g／g.

图1 猪膝关节软骨脱细胞基质的染色观察（×400）Fig.1 Staining observation of pig knee joint acellular matrix

表1 软骨层、过渡层、硬骨层性能测定Table 1 Performance test of cartilage，interlayer and bone

按照各层支架优化后的技术参数制作一体化支架.一体支架的光学照片见图2a，圆柱状、白色、表面粗糙.支架分为三层，上层为软骨层，中间为过渡层，下层为硬骨层.由支架的横截面电镜照片（图2b）可以看出支架各层连接紧密，由图2c可以看出层内与层间孔道相通，连通性良好.由图2d、2e、2f电镜图可以看出支架的孔径大小与致孔剂的粒径大小有关，软骨部分孔径大小为（125±10）μm、过渡层孔径为（30±5）μm左右、硬骨部分孔径大小为（300±35）μm.

图2 支架宏观图及电镜图Fig.2 Microstructure and SEM of scaffold

从表2（P111）可以看出支架在1h时吸水率已经达到75%以上，5h时吸水率剧增达到200%以上.这说明支架的吸水率很好，为后期BMSC与支架的复合培养奠定了基础.

表2 一体化支架的吸水率Table 2 Water absorption of integrative scaffold

2.3 BMSC与关节一体化支架的复合培养

经全骨髓分离法提取得到BMSC，在首次换液后的第2天出现零星的贴壁细胞，见图3a.在第5天时，开始出现漩涡状的细胞群，见图3b.在第9天时，细胞增殖融合达到整个细胞瓶底的80%以上，见图3c.全骨髓分离法提取的细胞增殖能力强，在换液过程中逐渐去除不贴壁的杂细胞，得到纯BMSC.

图3 倒置显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞（×100）Fig.3 Observation of rabbit bone marrow stromal cells under inverted microscope（×100）

将第二代BMSC与支架共培养10d后经MTT法检测得到的结果（表3）.进行t检测统计分析.可见空白软骨、空白硬骨与对照组二者之间差异非常显著（P＜0.01），说明支架适合细胞的生长.复合软骨与空白软骨二者之间差异显著（P＜0.05），说明ACTM为细胞的生长提供了营养；复合硬骨与空白硬骨二者之间差异显著（P＜0.05），说明添加了β－TCP后支架表面更加粗糙，有利于细胞的黏附.

表3 细胞在支架上的生长Table 3 Cell growth on the scaffold

图4 扫描电镜下观察兔骨髓间充质干细胞黏附在支架上Fig.4 Rabbit bone marrow stromal cells were attached to scaffold under SEM

扫描电镜观察表明，BMSC在支架的软骨层和硬骨层都可以完全黏附，而且细胞表面有分泌物的产生（图4a、4b），表明一体化支架无毒，且内部结构适宜细胞的生长.

3 讨论

关节骨软骨拥有复杂的解剖学结构，从软骨顶层到硬骨依次为软骨储备区、软骨增生区、软骨成熟区、软骨钙化区、成骨区，如果严格按照关节结构设计支架比较困难，因此在支架制备时设计了一个过渡层而代之.过渡层的致孔剂粒径≤38μm，获得的孔径约在30μm左右，可以阻止成骨细胞的迁移以及血管伸入软骨部分.将过渡层的孔隙率控制在70%以上，以便于营养物质和代谢废物的交换输送.

在软骨部分复合了ACTM，为BMSC的生长、增殖、分化提供了营养成分并促进软骨组织形成.硬骨部分复合了β－TCP，β－TCP有较强的力学强度，其表面部分遇水后会形成羟基磷灰石结晶，成为硬骨的主要无机成分，很好的仿生了骨的物质结构，也使支架表面更加粗糙有利于BMSC的黏附.

采用溶剂浇铸－粒子滤沥法，制备软骨层／过渡层／硬骨层三层一体化支架的过程中，以PHBHOx为连续相，建立了分步操作一次成型新工艺.

BMSC与支架复合培养试验结果表明支架不仅对细胞无毒性，而且为细胞生长提供了良好的生存环境.这一结果也说证实在支架制备过程中没有氯仿残留.

关节一体化组织工程支架的成功制作，仅为关节组织工程研究奠定了支架基础，接下来尚有一系列的研究工作有待进行，如生长因子的介入及体内外的细胞及组织培养、关节损伤修复的动物试验、临床试验等.

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