类叶牡丹皂苷G在大鼠体内的组织分布研究

梁军，宋艳，刘俊希，苑宏宇，黄晓莹,夏永刚*，匡海学*

(1.黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

类叶牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim.)，别名红毛七、威严仙、红毛细辛等，为小檗科红毛七属多年生草本植物，根及根茎为主要药用部位。类叶牡丹曾记录于《中药大辞典》，其性温，味苦辛，归肝、胃经，具有理气止痛、祛风活血的功效[1]。现代药理学研究表明类叶牡丹具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和抗类风湿关节炎等作用[2-5]。广泛生长于东北地区、西北地区、西南地区等的林下或者山沟阴处。在陕西地区，与桃儿七、铁牛七、朱砂七等并称为“太白七药”，被记载于《本草纲目》，“凡杖扑伤损，瘀血淋漓者，随即嚼烂，罨之即止，青肿者即消散”，所以也是治跌打、除风湿的民间常用药[6]。

类叶牡丹皂苷G(Cauloside G)是类叶牡丹中主要的特征性成分，目前对于Cauloside G的组织分布研究鲜有报道，在课题组前期对类叶牡丹皂苷成分的化学及质谱分析的基础上[7-11]，本实验进行Cauloside G的组织分布研究，建立了一种UPLC-MS/MS法，测定Cauloside G在大鼠体内各主要脏器中的分布特点及组织药物浓度随时间变化的动态规律，为类叶牡丹中三萜皂苷类成分的进一步开发和利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂

对照品Cauloside G，自制，经高效液相-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测，纯度>98%；内标伪薯蓣皂苷(IS)购自于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈和甲醇均为色谱级，购自于Thermo Fisher, Geel, Belgium；甲酸购自于Dikma,Lake Forest,USA；其他试剂均为分析级。水为纯净水，经Milli-Q纯化过滤后使用。肝素钠购自中国惠世生化试剂有限公司。

1.2 仪器

4000 QTRAP三重四级杆线性离子阱串联质谱仪(美国AB Sciex公司)；组织匀浆机(上海净信公司);Mettler-Toledo AB265-S天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.3 实验动物

健康清洁级SD大鼠，雄性，体质量180～220g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证编号为SYXK(黑)2013-012。本实验符合实验动物伦理委员会的伦理学标准。

2 实验方法和结果

2.1 色谱及质谱条件

类叶牡丹皂苷G液相色谱条件：色谱柱采用 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×150 mm,1.8 μm)、HSS T3预柱(2.1 mm×5 mm,1.8 μm)；流动相A：水(含0.1%甲酸)，流动相B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱，洗脱程序为0～4 min,30%～90% B;4～4.1 min,90%～30% B;4.1～5 min，30%～30% B。柱温35 ℃ ,流速0.3 mL·min-1,进样量5 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；ESI-负离子模式，多重反应监测(MRM)。

2.2 对照品溶液配制

母液配制:精密称取Cauloside G为1.00 mg，用甲醇定容至1 mL EP管中，得到 1.00 mg/mL 母液，贮存于4 ℃冰箱中待用。

标准曲线工作液配制：分别精密移取上述标准品母液(1.00 mg/mL)，用甲醇稀释得到100.0、10.0、1.0 μg/mL标准溶液。取大鼠心、肝、脾、肾、脑的空白组织匀浆液200 μL，分别精密加入Cauloside G和伪薯蓣皂苷内标，配制成相当于大鼠各组织药物浓度的系列溶液：心(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)；肝(8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5、555.0和1 110.0 ng/mL)；脾(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5和555.0 ng/mL)；肾(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8277.5和555.0 ng/mL)；脑(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)，所有标准曲线工作液4 ℃条件下储存。

质控样品(QC)工作液配制：精密吸取Cauloside G标准品工作液(1.00 mg/mL)适量，同法配制低、中、高浓度混合质控(QC)样品工作液，分别为心(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，肝(11.1、111.1、1 110.0 ng/mL)，脾(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，肾(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，脑(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，所有工作液4 ℃条件下储存。

内标及工作液的配制：精密称取伪薯蓣皂苷1.01 mg，用甲醇定容至1 mLEP管中，配置成浓度1.00 mg/mL母液。精密吸取伪薯蓣皂苷母液，用甲醇稀释得到100.0、10.0、1.0 μg/mL工作液。再精密吸取内标工作液，配制成200 ng/mL内标工作液，贮存于4 ℃冰箱中备用。

2.3 动物实验

将30只雄性SD大鼠按照5个时间点随机分成5组，每组6只，除空白组给予等量的生理盐水外，其余各组按照150 mg/kg剂量、单次灌胃给予Cauloside G，于给药后0.5、1、2、4和6 h分别腹主静脉采血后处死，立即解剖大鼠，摘取心、肝、脾、肾及脑等组织样品，用生理盐水冲洗至表面无血污后，滤纸吸干水分，-20 ℃保存待匀浆。

2.4 组织样品的预处理

取-20 ℃保存的心、肝、脾、肾、脑组织样品，室温解冻后，精密称重后，加入定量的生理盐水(1 g组织加入5 mL生理盐水)，用组织匀浆器充分匀浆。取200 μL血浆和空白血浆分别加入400 μL甲醇，涡旋1 min，再加入1 mL甲醇，涡流混旋1 min后，在4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液，40 ℃氮气流下吹干，残渣加甲醇100 μL复溶，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，5 μL注入LC-MS/MS系统进行分析。

2.5 方法学验证

2.5.1 选择性

取各组织空白生物样品、加入标准品Cauloside G和IS的心、肝、脾、肾、脑组织样品及大鼠给药单体Cauloside G典型的色谱图如图1所示。结果表明，各组织中内源性物质对于单体Cauloside G的检测没有干扰。

注:A：空白生物样品；B:加入标准品Cauloside G和IS的组织样品；C：大鼠给药Cauloside G的各组织样品。图1 各组织典型的色谱图

2.5.2 标准曲线和最低定量限

如表1所示，是类叶牡丹皂苷Cauloside G在心、肝、脾、肺、肾、脑的标准曲线、相关系数、线性范围最低定量限(LOQ)。在线性范围内，其线性相关系数(R2)均大于0.99，表明Cauloside G相应浓度与其峰面积与内标峰面积比值具有良好的线性关系。LOQ是分析方法灵敏度的评价方法，LOQ满足准确度为101.3%～105.30%，RSD<2.13 %，足以用于组织分布的分析。

表1 Cauloside G在不同组织中的标准曲线、线性范围及最低定量限(n=6)

2.5.3 准确度和精密度

待测物的日内和日间精密度的RSD值均低于15%，准确度(RE)在-14.63 %～14.02%之间。结果表明，该方法的准确度和精密度良好。

2.5.4 提取回收率和基质效应

Cauloside G在各组织样品中的提取回收率为87.45%～95.22%，RSD<7.90%；在三个不同的浓度基质效应为71.89%～82.32%，RSD<6.54%。以上结果表明，本方法能满足各组织样品的定量分析要求。

2.5.5 稳定性

结果表明该分析物在4 ℃存储12 h、-20 ℃储存2周、-20 ℃储存并反复冻融3次等条件下是稳定的，准确度符合要求。

2.6 大鼠灌胃Cauloside G的组织分布研究

各组织按照“2.4组织样品的预处理”项下操作，测定类叶牡丹中Cauloside G成分在大鼠各个脏器不同时间点的分布情况，结果见表2。结果表明，大鼠灌胃给予Cauloside G后，Cauloside G在大鼠的心、肝、脾、肾和脑中均有分布。心脏组织中，Cauloside G是在给药0.5 h后浓度达到最高值，浓度为(53.7±7.60)ng/mL；肝、脾、肾、脑组织中，Cauloside G是给药1 h后浓度达到峰值，浓度分别为(90.1±6.19)ng/mL，(103.2±17.67)ng/mL，(101.8±14.32)ng/mL，(68.2±14.76)ng/mL。

表2 Cauloside G在各组织中不同时间点的质量浓度(n=6,ng/mL)

3 小结

药物在体内分布的速度决定了药效发挥的快慢，分布迅速，药效产生快，反之分布较慢，药效产生慢[12]。本文研究表明Cauloside G灌胃给予大鼠后，心脏组织中，Cauloside G在是在给药0.5 h后浓度达到最高值，给药0.5 h后显示浓度开始下降；肝脏组织中，给药0.5～1 h内Cauloside G的浓度均呈现升高的状态，给药1h后显示浓度开始下降；脾组织中Cauloside G是在给药1 h后达到浓度峰值，浓度为(103.2±17.67)ng/mL，与其他组织相比，对脾组织表现出了更好的亲和力；肾组织中，Cauloside G是在给药后1 h迅速达到峰值；脑组织中，Cauloside G在给药1 h后药物浓度最高，随后缓慢下降，在脑组织内表现出了缓慢代谢的特性。

总体来看，Cauloside G在肝、脾、肾这些血流量大的组织中的含量较高，对这些组织具有很好的亲和力，而随着时间延长药物质量分数迅速下降，提示Cauloside G可能通过多途径代谢；心脏组织中，Cauloside G表现出了分布迅速的特性；在脑组织中，Cauloside G成分也有分布，说明这个成分能够透过血脑屏障。本文在一个选定的有效剂量单次给药后，测定Cauloside G在大鼠体内不同组织中的分布特点及组织药物浓度随时间变化的动态规律，为类叶牡丹中三萜皂苷类成分的临床应用和进一步解释其作用机制提供实验依据。