胸水中LPS、IL-35、RORα在结核性胸腔积液中的表达变化及临床意义

吴艳飞 张令

湖北文理学院附属医院 襄阳市中心医院呼吸与危重症医学科441000

胸膜炎是由各种致病因素刺激胸膜所致的胸膜炎症,结核性和癌性是其主要病因[1]。结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的鉴别诊断通常需要结核分枝杆菌的检出或胸膜活检的阳性报告,但胸腔积液中结核分枝杆菌含量低,涂片检测抗酸杆菌阳性率＜5%,且胸膜活检存在有创、标本采集困难、重复性差等不足,因此目前临床鉴别诊断结核性胸膜炎与恶性胸膜炎比较困难[2]。IL-35是一种由调节性T 细胞分泌的抑制性细胞因子,具有抑制细胞增殖、抑制炎症反应等作用,还与感染性疾病、呼吸系 统 疾 病 等 密 切 相 关[3]。 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁主要成分,由脂质和多糖构成,能够释放内源性活性因子,诱导肺部损伤[4]。维甲酸相关孤儿受体α(retinoic acid related orphan receptorα,RORα)是ROR 家族中的重要一员,在淋巴细胞发育、脑部发育等生理过程中具有重要调控作用,并与结核病有关[5]。既往研究报道[6-7]胸水LPS、IL-35、RORα水平检测有助于了解结核性胸膜炎病情,但其多为回顾性分析,且存在样本小、时间短等不足。因此,本研究分析了胸水LPS、IL-35、RORα在结核性胸腔积液中的表达变化及临床意义,以期为临床鉴别诊断结核性和恶性胸膜炎提供理论基础,现将研究结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 采用回顾性研究方法,经襄阳市中心医院医学伦理委员会批准,选择2017年1月至2020年1月襄阳市中心医院收治的79例结核性胸膜炎患者为结核组,66例恶性胸膜炎患者为恶性组。结核组中男47例,女32 例,年龄范围为18～77岁,平均年龄 (48.56±10.54)岁;体质量指数(22.46±2.71)kg/m2;吸烟史47例;饮酒史32例。恶性组中男40例,女26例,年龄范围为18～78 岁,平均年龄 (49.99±10.28)岁;体质量指数 (22.58±2.65)kg/m2;吸烟史38例;饮酒史26 例;发病原因:肺癌胸腔转移44例,胸膜间皮瘤9例,胃癌胸腔转移8例,妇科恶性肿瘤胸腔转移5例。恶性组与结核组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义,具有可比性。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准:(1)结核性胸膜炎经结核菌细菌学检查和病理学检查确诊[1];(2)恶性胸膜炎经胸腔镜取胸膜病理活检或胸水脱落细胞学检查确诊[2];(3)无凝血系统疾病;(4)依从性好,能配合完成本研究;(5)所有研究对象及家属知情同意并签署知情同意书。排除标准:(1)合并精神系统疾病、风湿性疾病、感染性疾病、心血管疾病、甲状腺疾病、传染性疾病、内分泌疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病;(2)机体重要脏器功能不全;(3)入院前接受任何与恶性胸膜炎和结核性胸膜炎有关的治疗;(4)结核病与恶性肿瘤同时存在;(5)妊娠期或哺乳期妇女;(6)入院资料不齐全。

1.3 研究方法 2组患者入院后收集其相关信息,包括年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史等,然后对2 组患者行胸腔穿刺术。采集胸水10 ml,采用北京北加美因生物技术有限公司的XL90 超速低温离心机,离心半径为15 cm,3 000 r/min离心10 min,分离上清液。采用酶联免疫吸附试验检测胸水LPS、IL-35、RORα水平,仪器为北京华安麦科生物技术有限公司的HF4500酶标仪,LPS试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司,IL-35试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司,RORα试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。所有操作由同一名经验丰富的专业检验科医师严格按照说明书进行。

胸腔穿刺术操作如下:患者取坐位,面向椅背,双手前臂平放在椅背上,前额伏于前壁上。胸腔穿刺抽液之前,先进行胸部叩诊,选择实音明显的部位,用碘酒或酒精消毒穿刺点部位皮肤。解开穿刺包,佩戴无菌手套,检查穿刺包内器械是否齐全,穿刺针是否通畅。铺盖消毒洞巾,采用2%普鲁卡因溶液,在穿刺点肋骨上缘,从皮肤到胸膜壁层,行局部麻醉。在麻醉药注射前要回抽,观察无血液、胸水、气体后方可推注麻醉药。

酶联免疫吸附试验操作如下:在酶标包被板上设标准品孔10孔,用标准品稀释液梯度稀释标准品。稀释后各孔加入待测样品50μl,37 ℃温育30 min,洗涤缓冲液洗涤5次;每孔加入酶标试剂50μl,37 ℃温育30 min,洗涤缓冲液洗涤5 次;先后加入显色剂A 50μl、显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37 ℃避光显色15 min,每孔加终止液50μl;终止反应 (蓝色立转黄色)后15 min内以空白孔调零,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例(%)形式表示,采用χ2检验进行比较。计量资料以±s 表示,采用t检验进行比较。采用spearman 相关分析胸水LPS、IL-35、RORα水平与结核性胸膜炎的相关性,采用多因素logistic回归分析结核性胸膜炎的影响因素,采用受试者工作特征曲线分析胸水LPS、IL-35、RORα对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的鉴别诊断价值。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组胸水LPS、IL-35、RORα水平比较 结核组胸水LPS水平显著高于恶性组 (t=2.691,P ＜0.05);结核组胸水IL-35水平显著高于恶性组(t=2.908,P ＜0.05);结核组胸水RORα水平显著高于恶性组(t=6.017,P ＜0.05)。见表1。

表1 2组患者胸水中LPS、IL-35、RORα水平比较 (±s)

表1 2组患者胸水中LPS、IL-35、RORα水平比较 (±s)

注:LPS为脂多糖;RORα为维甲酸相关孤儿受体α

组别例数LPS (μg/L)IL-35 (ng/L) RORα(μg/L)结核组79 2 030.17±540.32 530.47±311.52 239.11±84.45恶性组66 1 020.57±387.74 400.24±205.38 169.34±45.59 t 值2.691 2.908 6.017 P 值＜0.001 0.004 0.001

2.2 胸水LPS、IL-35、RORα水平与结核性胸膜炎的相关性 结核组赋值为1,恶性组赋值为0,进行spearman相关分析,胸水LPS水平与结核性胸膜炎呈正相关 (r =0.375,P ＜0.05);胸水IL-35水平与结核性胸膜炎呈正相关 (r=0.583,P ＜0.05);胸水RORα水平与结核性胸膜炎呈正相关(r=0.604,P ＜0.05)。

2.3 多因素logistic分析结核性胸膜炎的影响因素 以潜在危险因素变量作为自变量,结核性胸膜炎作为因变量,运用各因素平均值作为分界点分别赋值0和1 (表2),带入logistic回归模型中,进行多因素分析。结果显示,胸水LPS水平升高是结核性胸膜炎的危险因素(P ＜0.05),胸水LPS水平升高者发生结核性胸膜炎的风险是胸水LPS水平正常者的4.550倍;胸水IL-35水平升高是结核性胸膜炎的危险因素 (P ＜0.05),胸水IL-35水平升高者发生结核性胸膜炎的风险是胸水IL-35水平正常者的3.720倍;胸水RORα水平升高是结核性胸膜炎的危险因素 (P ＜0.05),胸水RORα水平升高者发生结核性胸膜炎的风险是胸水RORα水平正常者的3.358倍。见表3。

表2 赋值表

2.4 胸水LPS、IL-35、RORα对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的鉴别诊断价值 胸水LPS对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的准确性明显高于胸水RORα(P ＜0.05);胸水IL-35 对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的准确性明显高于胸水LPS (P ＜0.05);胸水LPS、IL-35、RORα联合检测对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的准确性明显高于各项指标单独检测(P ＜0.05)。见表4、图1。

图1 胸水LPS、IL-35、RORα鉴别诊断结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的受试者工作特征曲线

3 讨论

胸膜炎是呼吸系统常见疾病,临床表现一般为咳嗽、气急、胸闷、胸痛、呼吸困难等。胸膜炎发生的最常见原因是结核病和恶性肿瘤。结核性胸膜炎是结核分枝杆菌及其代谢产物、自溶产物入侵机体胸膜腔而引发的胸膜炎症,属于国家法定传染病丙类,约占胸膜炎的30%～80%[8]。恶性胸膜炎是由癌细胞刺激胸膜所致的胸膜炎症,约占胸膜炎的20%～60%,是肺癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤晚期的常见并发症,恶性胸膜炎的发生提示患者癌细胞全身扩散转移,患者的生活质量下降,患者生存时间缩短[9]。2种性质的胸膜炎给机体造成的影响不同,治疗方法也有很大差别,因此准确鉴别诊断结核性胸膜炎与恶性胸膜炎有助于早期诊断、尽早治疗。目前结核性胸膜炎与恶性胸膜炎主要依赖于特异性病原体的检出或活体组织的病理学证据,但胸腔积液中结核分枝杆菌含量少,涂片阳性率不足5%,培养耗时太长,且胸膜活检行胸腔穿刺时具有一定创伤,胸腔积液采集困难,很难获取合格标本,实验重复性差,多数结果为非特异性表现[10]。因此,寻找有效检测方法对鉴别诊断结核性胸膜炎与恶性胸膜炎有着重要的临床指导意义。

IL-35是IL-12家族中的新成员,为一种新型具有炎症抑制作用的细胞因子,由IL-27 的亚基EB病毒诱导蛋白3和IL-12的亚基p35共同构成。大量研究[11-13]发现:(1)在平滑肌细胞、血管内皮细胞以及被炎症介质活化后的单核细胞内都能检测到IL-35基因表达,EB病毒诱导蛋白3、p35在人胎盘滋养细胞中呈高表达,提示IL-35可能参与母体和胎儿之间的免疫耐受。 (2)IL-35 可诱导CD4+T 细胞产生诱导性调节性T 细胞 (induced regulatory T cell,iTreg),iTreg 又可分泌IL-35而促进产生更多的iTreg,从而使二者形成正反馈。(3)IL-35能够抑制胶原诱导性关节炎大鼠局部免疫反应,缓解其关节炎症状,从而延缓胶原诱导性关节炎大鼠病情进展。在炎症性肠病和自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现,IL-35 能够诱导CD4+T 细胞分化成一种新型调节性T 细胞。 (4)IL-35可通过抑制IL-17分泌,降低哮喘小鼠气道高反应性,进而改善哮喘症状。IL-35可参与乙肝后肝硬化和肝纤维化免疫抑制,有望成为肝硬化新治疗靶点。IL-35在鼻咽癌组织中表达水平异常高于炎性病理组织和癌旁病理组织,IL-35表达水平与鼻咽癌组织分型、局部淋巴结转移、临床分期关系密切。(5)IL-35可通过激活Janus激酶2/信号转导因子和转录活化因子3信号通路,参与感染性疾病发生及发展。IL-35在慢性乙型肝炎患者外周血中呈高表达,且IL-35能减弱细胞毒性CD8+T细胞的杀伤力而造成病毒持续感染。(6)肺结核患者支气管肺泡灌洗液中IL-35呈高水平。本研究显示结核组胸水IL-35 水平显著高于恶性组,提示IL-35可能与结核性胸腔积液有关。

LPS是革兰阴性菌细胞壁主要成分,也是革兰阴性菌主要致病成分,极少数存在于真菌、革兰阳性杆菌、支原体中。LPS 通常在细菌死后其细胞壁崩解时释放,活菌亦可以发疱形式将LPS释放。LPS由脂质和多糖构成,能够释放内源性活性因子,抑制细胞滋养细胞迁移,诱导血管内皮细胞损伤,诱导机体重要脏器损伤,其生理作用是通过宿主体内各细胞膜表面的Toll样受体4而体现的。大量研究[14-16]显示: (1)LPS能够与细胞膜表面的Toll样受体4 结合,将信号转至细胞内,通过MyD88依赖性信号转导通路,激活下游的核转录因子κB信号途径和丝裂原活化蛋白激酶信号途径,促进多种细胞因子转录和表达,从而促使大量炎性介质释放; (2)LPS能够促进血管平滑肌细胞释放IL-8,从而趋化中性粒细胞; (3)LPS调控牙髓干细胞黏附、迁移及成脂分化,动脉外膜成纤维细胞可在LPS刺激下合成多种细胞趋化因子,如调节活化蛋白、IL-8等; (4)胸水LPS可参与肺结核局部炎症反应以及免疫反应。本研究显示胸水LPS在结核性胸膜炎患者中呈高水平,提示LPS可能参与了结核性胸腔积液形成。

表4 胸水LPS、IL-35、RORα对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的鉴别诊断价值

ROR 是孤儿核受体家族中的重要成员之一,包括RORα、RORβ、RORγ3 种亚型。RORα 是最早发现的亚型,广泛表达于肝、肺、肾、大脑、胸腺、骨骼肌等多种组织中,在淋巴细胞发育、脑部发育等生理过程中具有重要调控作用,并与2型糖尿病、脂质代谢异常、自身免疫性疾病、代谢性疾病及肺癌、食管癌、肝癌等恶性肿瘤发病及病情进展密切相关。临床已将RORα作为靶点,研发新型药物,应用于各类疾病的治疗。既往研究[17-19]显示:(1)RORα是Th17细胞分化过程中的关键因子之一,RORα激动剂是临床抗炎症的重要方向。研究发现,RORα在T 细胞系发育中具有重要作用,在RORα敲除状态下,T 淋巴细胞发育受到明显影响。(2)RORα基因多态性与哮喘易感性增加有关。(3)RORα可通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B 通路抑制胃癌细胞增殖。 (4)RORα基因敲除的小鼠对LPS诱导的肺部炎症不易感。(5)结核性胸腔积液中RORα水平较非结核性胸腔积液显著上升。本研究显示胸水RORα在结核性胸膜炎患者中呈高水平,提示RORα可能参与了结核性胸腔积液形成。

本研究显示,胸水LPS、IL-35、RORα水平升高是结核性胸膜炎的危险因素,胸水LPS、IL-35、RORα联合检测对结核性胸膜炎与恶性胸膜炎具有较高的鉴别诊断价值,即结核性胸膜炎患者入院时胸水RORα＞1 507.75 μg/L、LPS＞285.35μg/L、IL-35＞197.03 ng/L,则可提示结核性胸膜炎发病风险较大,临床针对此类患者需多加关注,准确鉴别,以降低漏诊、误诊率。

综上所述,胸水LPS、IL-35、RORα在结核性胸膜炎患者中呈高水平,胸水LPS、IL-35、RORα联合检测在结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的鉴别诊断中价值较高,有望在临床上推广。鉴于其机制不明,仍需要深入研究。

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