规模化羊场支原体感染的流行病学调查

王雅雯，李仕林，姜水兵，郭良帅，努尔麦麦提·麦麦提敏，焦海宏

（塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔843300）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasmasheep pneumoniae）是由绵羊支原体（Mycoplasma ovis，MO）引起的具有传染性的典型性肺炎[1-3]。绵羊和山羊均可感染支原体，且羔羊的发病率和死亡率较高，成为危害养羊业发展的主要传染病之一。支原体肺炎临床症状表现为发热、咳嗽、腹式呼吸、渐进性消瘦及增生性、化脓性肺炎。单纯由绵羊支原体引起的绵羊肺炎支原体通常呈慢性肺炎，早期大多数病羊没有明显临床症状，当与其他病原体交叉感染或发生应激时会出现常见的肺炎感染症状，感染率和死亡率较高[4]。研究表明，绵羊支原体不仅在患病羊的肺中可以分离得到，在健康羊的肺中也可分离得到[5-8]。

近几年，国内部分省先后开展区域性绵羊支原体感染的流行病学调查。绵羊支原体本身并不会对宿主机体造成严重损害，通常只是慢性肺炎，只有在继发性感染其他病原体或发生应激时才会导致病情发展成常见的肺炎感染症状[9]。绵羊支原体对山羊和绵羊有很强的致病性，绵羊感染后发病率很高。近年来，此病的死亡率不断上升，严重威胁着绵羊和山羊的生产效率，可为羊养殖业造成严重的经济损失。

1 材料与方法

1.1 样品采集

规模化羊场采集羊血液样品169份；乌什某规模化羊场病羊组织样品2份；某规模化羊场羊血清DNA样本15份；塔里木大学试验站的疑似病例鼻拭子2份、病死羊1只。

1.2 试验试剂

TE缓 冲 液、2XPowerTaqPCRMasterMix、D2000、GeneGreen核酸染料购自北京天根生物工程有限公司；DNAzolReagent购自美国英杰生命技术有限公司；羊支原体抗体检测试剂盒购自深圳市豫崧生物技术有限公司。

1.3 分子鉴定

根据患病羊的流行病学资料、临床症状和解剖病理变化等，初步判断为支原体感染。根据参考文献[10]中的已知引物序列进行分析验证，合成支原体属绵羊支原体检测引物。lmf：GACTTCATCCTGCACTCTGT；lmr：TGAACGGAATATGTTAGCTT，产物长度361 bp，由北京华大基因进行合成。使用DNAzol Reagent提取疑似发病羊的肺脏、脾脏、鼻拭子样品的DNA，具体操作步骤均参考说明书进行。以提取的DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系（25μL）：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL、去离子水9.5μL、提取DNA 2μL、上下游引物各0.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，72℃延伸5 min，35个循环，4℃保存。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳完成后在凝胶成像仪中观察结果。

1.4 血清抗体监测

对规模化羊场的羊血清进行羊支原体抗体检测，检测方法按试剂盒说明书进行。试验建立的前提条件为阴性对照（N）OD值＜0.2，且阳性对照（P）OD值＞0.5。判定标准：S/P值=样品OD值/阳性对照OD平均值，S/P值≥0.4则为阳性；S/P值＜0.4则为阴性。

2 结果与分析

2.1 解剖病理变化

病羊病理变化主要为肺泡充血、病变部位肺容积增大、断面光滑、肺放入水中不下沉、肺组织变软。

2.2 支原体病原学检查结果（见图1）

图1 绵羊支原体基因片段PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of Mycoplasma ovis gene fragments

支原体病原学检查结果阳性样品4个，其中乌什绵羊场1个；某规模化羊场3个，阳性率为26.67%（4/15）；试验站疑似病例未检出。

由图1可知，4份阳性样品基因片段均在361 bp，与支原体通用引物基因片段一致。

2.3 绵羊支原体肺炎血清学检测结果（见表1）

表1 绵羊肺炎支原体血清学检测结果Tab.1 Serological test results of Mycoplasma sheep pneumoniae

由表1可知，阿拉尔市阳性率为58.82%；沙雅县阳性率为84.00%；民丰县阳性率为48%；策勒县阳性率为50.00%；乌什县42.11%，5个县合计阳性率为52.07%。

3 讨论

绵羊肺炎支原体是绵羊养殖过程中常见的呼吸道传染病之一，对养羊业的健康发展造成极大的影响.长期以来，我国对绵羊肺炎支原体没有得到较好的控制。该病原可长期存在动物体内，难以及时发现，当出现明显的临床症状时往往发病较为严重，易造成死亡。

本次试验通过使用PCR和ELISA方法检测规模化羊场进行绵羊支原体。PCR检测的阳性率为26.67%。经序列对比后发现，本试验的PCR产物与NCBI公布的1株美国肺炎支原体分离株和1株土耳其绵羊肺炎支原体分离株同源性为100%。分子生物学证明本试验检测到的为绵羊肺炎支原体。ELISA检测结果显示，南疆各规模化羊场绵羊肺炎支原体的阳性率为52.07%。乌什县某规模化羊厂中有7份样品的S/P值大于1，经过临床观察该7只羊都有明显的呼吸道症状，表明样品的S/P值大于1，临床上会出现明显羊支原体肺炎的症状，而其他羊存在着支原体感染，只是在临床上未表现出来。

剡文亮等[11]研究表明，新疆5个地区的规模化羊场的羔羊血清绵羊支原体抗体阳性率为46.66%～100.00%，表明5个地区的羊场都被绵羊支原体感染；山羊肺炎支原体抗体阳性率为19.05%～58.33%,说明山羊肺炎支原体抗体和抗原阳性低于绵羊支原体阳性率。吴锦艳等[12]研究表明，国内部分地区羊血清中绵羊支原体阳性率为31.92%，山羊支原体山羊肺炎亚种阳性率为10.67%，说明我国养羊地区大多都存在羊支原体肺炎的感染。

4 结论

本试验结果表明，PCR检测的阳性率为26.67%。ELISA检测结果显示，南疆各规模化羊场绵羊肺炎支原体的阳性率为52.07%。结果提示，羊场应进一步加强饲养管理和本病的防控。