草鱼NK-lysin基因生物信息学分析

张梦帆，王进千，刘丽霞，王 瑞

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030）

NK-lysin是一种抗菌肽，由机体自然杀伤细胞和毒性T细胞分泌[1]。NK-lysin作为一种抗菌肽在生物体内分布比较广泛且具有高效广谱抗菌活性，能够分泌到淋巴细胞外发挥免疫防御功能[2-3]。NK-lysin具有与膜结合的能力，能够改变细胞膜的完整性，深入细胞质内，进而导致细菌基因组降解，与颗粒溶素在结构和功能上有着很大的相似性[4]。NK-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白（saposin-like protein，SAPLIP）家族的成员，具有鞘脂激活蛋白B（saposin B）结构域和6个保守的半胱氨酸，能够杀灭细菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞等[5]。鱼类NK-lysin的抑菌种类中包括一些常见的水产动物病原菌。NK-lysin有助于鱼类抗菌药物的研发，可为鱼类的细菌性研究做出贡献，也可为其他细菌性疾病的防治奠定一定的基础[5]。

草鱼属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科，是我国最大产量的淡水养殖鱼类[6]。草鱼在养殖过程中生病率和死亡率很高[7]。NK-lysin基因是重要的免疫基因，对这一基因的生物信息学分析可以对以后鱼类的免疫提供参考。

1 材料与方法

1.1 NK-lysin基因序列

草鱼NK-lysin基因的氨基酸序列来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，Cinkl登录号为kx631937，其序列为：M LP CIL LA TL LI SSV C AF DM EM HR G N F T E D E LE QIS GE M APA QQ LPG LC WA C KW A M G K V K GL ISR TA T PSDI KR A LS HVC DE IG F L K F M C R I FV NK YL G VL IEE LS TTDD AR TIC V H V G V C。

1.2 NK-lysin基因序列的开放阅读框分析

使用NCBI网站中http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html在线分析软件进行NK-lysin基因序列的开放阅读框分析。

1.3 NK-lysin基因的理化性质分析

利用http://web.expasy.org/protparam/网站中ProtParam工具对NK-lysin基因进行理化性质参数的分析。

1.4 NK-lysin基因的疏水性/亲水性预测与分析

利用ProtScale在线预测工具http://web.expasy.org/protscale/对草鱼NK-lysin基因进行疏水性/亲水性的预测与分析。

1.5 NK-lysin的基因跨膜区分析

利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/网站中在线蛋白质跨膜区分析工具TMHMM对草鱼NK-lysin进行跨膜区的预测。

1.6 NK-lysin基因的二级结构预测

https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html运用网站二级结构预测的工具进行草鱼NK-lysin基因的二级结构预测。

1.7 NK-lysin基因的磷酸化位点/N-糖基化位点分析

利用网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/预测NK-lysin基因的磷酸化位点，利用网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/预测NK-lysin基因的N-糖基化位点。

2 结果与分析

2.1 草鱼NK-lysin蛋白质开放阅读（ORF）预测（见图1）

ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件[8]。

由图1可知，NK-lysin基因开放阅读框全长213 bp，起始密码子为ATG，编码121个氨基酸。

图1 NK-lysin基因ORF分析结果Fig.1 Analysis results of NK-lysin gene ORF

2.2 草鱼NK-lysin基因的氨基酸组成（见表1）

草鱼NK-lysin的分子式为C591H951N155O170S14，氨基酸数量121个。由表1可知，草鱼NK-lysin共有20种基本氨基酸。NK-lysin的分子质量为13 396.83 u，等电点为5.53，带负电残基总数（Asp+Glu）14个，正电荷残基总数（Arg+Lys）11个。在体外，NK-lysin基因半衰期为在哺乳动物网织红细胞内为30 h。在酵母中半衰期大于20 h，在大肠杆菌内半衰期大于10 h。不稳定指数计算为44.09，这将NK-lysin基因归类为不稳蛋白。疏水性总平均值（GRAVY）为0.361，说明草鱼NK-lysin为疏水蛋白。

表1 草鱼NK-lysin基因的氨基酸组成Tab.1 Amino acid composition of NK-lysin gene in grass carp

2.3 草鱼NK-lysin亲水性/疏水性预测与分析（见图2）

图2 草鱼NK-lysin亲水性/疏水性预测与分析Fig2 Prediction and analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of grass carp NK-lysin

由图2可知，草鱼NK-lysin亲水性最强位点出现在第27位苯丙氨酸，分值为-2.222，草鱼NK-lysin疏水性最强的位点出现在第8位丙氨酸。草鱼NK-lysin蛋白平均疏水性为0.361，疏水肽链分布在整个氨基酸序列中，且明显多于亲水性肽链，预测结果表明草鱼NK-lysin是一种疏水蛋白质。

2.4 草鱼NK-lysin跨膜区分析

使用在线蛋白质跨膜区分析工具TMHMM软件对草鱼NK-lysin进行跨膜区分析。结果显示，草鱼NK-lysin不含跨膜区，说明草鱼NK-lysin不是跨膜蛋白质。

2.5 草鱼NK-lysin蛋白质二级结构预测（见图3）

图3 草鱼NK-lysin蛋白质二级结构预测Fig.3 Prediction of the secondary structure of grass carp NK-lysin protein

由图3可知，α螺旋有25个氨基酸残基参与占20.66%，延伸连有38个氨基酸残基参加占31.40%，无规则卷曲有58个氨基酸残基参与占47.93%。

2.6 草鱼NK-lysin蛋白质的磷酸化位点/N-糖基化位点分析（见图4、图5）

由图4、图5可知，草鱼NL-lysin蛋白质有6个Ser（Ser13、Ser36、Ser64、Ser70、Ser77、Ser106）位点和6个Thr（Thr9、Thr28、Thr66、Thr68、Thr107、Thr108）位点，总计12个潜在的磷酸化位点，但是仅有1个N-糖基化位点Asn26。

图4 草鱼NK-lysin蛋白质的磷酸化位点Fig.4 Phosphorylation site of grass carp NK-lysin protein

图5 草鱼NK-lysin蛋白质的N-糖基化位点分析Fig.5 Analysis of N-glycosylation site of grass carp NK-lysin protein

3 讨论

NK-lysin基因是Andresson等[9]在猪的脾脏和骨髓中首次发现的一种新的抗菌肽。王改玲等[5]研究表明，NKlysin基因在脾脏的表达量中极高，在头肾、腮、心脏等部位也保持着较高的表达量，而这些部位恰恰是免疫器官，同样说明NK-lysin基因发挥着重要的免疫作用。通过生物软件分析草鱼NK-lysin的生物信息学信息，有利于对该基因进行深入研究并进一步探究其作用机制[10]。本研究从生物信息学角度解析草鱼NK-lysin基因的序列特征。研究发现，草鱼NK-lysin基因全长121个氨基酸，通过理化性质的分析和亲疏水性的预测和分析可以确定草鱼NKlysin是一种疏水蛋白，其二级结构以无规则卷曲结构为主。蛋白质磷酸化在细胞信号转导的过程中起重要作用，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、最重要的机制，可使细胞产生应激反应或新陈代谢发生改变，从而起到调节蛋白质在信号转导中的作用，改变基因表达、细胞生长和分化[11]。草鱼NK-lysin蛋白有12个潜在的磷酸化位点，这些位点可能影响到某些细胞的代谢过程和信号转导。

4 结论

草鱼NK-lysin基因由121个氨基酸残基组成，属于疏水性蛋白，无跨膜区，具有潜在的磷酸化位点和糖基化位点，研究结果可为草鱼免疫相关基因调控的深入研究提供参考。