儿童急性淋巴细胞白血病中ABCB1 C3435T位点基因多态性对大剂量甲氨蝶呤血药浓度及不良反应的影响

孟 岑，徐 刚

0 引言

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最常见的一种儿童恶性肿瘤,其死亡率在儿童恶性肿瘤中居首位，严重威胁着儿童的生命[1]。目前，ALL主要的治疗方式为化学治疗，其中甲氨蝶呤是关键药物之一。在ALL的维持治疗和髓外防治中，大剂量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate,HD-MTX)的应用对疾病的治疗起到了非常重要的作用。

甲氨蝶呤是一种叶酸抑制剂，对二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)的亲和性更高，可与二氢叶酸竞争，使其无法还原成有活性的四氢叶酸，而四氢叶酸的缺乏会使DNA、RNA的合成过程受阻，进而影响肿瘤细胞快速增殖，导致其死亡。MTX进入细胞主要通过溶质载体(SLC) 19A1转运体(RFC1)介导，MTX进入细胞后，经过由多种代谢酶参与的复杂的代谢后，由ATP结合盒转运体(ATP-binding cassete，ABC)泵出。包括ABCB1和ABCC1-4等8个亚家族，其中ABCB1又名多药耐药基因1(MDR1)，ABCB1基因的编码产物是P-糖蛋白,能够介导甲氨蝶呤的外向排出，阻碍药物的吸收[2]。

MTX可引起多种不良反应，如肝脏毒性、肾脏毒性、血液毒性及皮肤黏膜毒性等，其中肝脏毒性最为常见。在临床应用中，其疗效与不良反应存在个体差异，其机制尚不明确。有研究认为，这种多样性可能和参与药物代谢、转运的基因序列改变有关[3]。目前，研究者对MTX代谢酶相关的基因多态性与其化疗不良反应之间的关系进行了研究，但结论未能达成一致。

本文选取2015年8月至2019年6月于我院小儿血液内科住院治疗的ALL患儿为研究对象，通过检测患儿ABCB1基因多态性，并监测其甲氨蝶呤治疗后的不良反应及血浆MTX浓度，探讨两者之间是否存在相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年8月至2019年6月于我院小儿血液内科住院治疗的ALL患儿132例，选取的患儿需完善骨髓穿刺并根据形态学(M)、免疫学(I)、细胞遗传学(C)及细胞分子生物学(M)检测并确诊为ALL患者。按照《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗规范(2018版)》的危险度标准分级。所有纳入患儿通过前期化学治疗后，骨髓完全缓解，化验血常规、肝功能、肾功能等指标基本正常，均符合进一步化疗标准。

1.2 化疗方案 在给予所有纳入研究患儿诱导缓解及早期强化治疗后，予HD-MTX方案治疗(低危组3 g/m2，中危组及高危组5 g/m2)，首先将MTX总量的1/6(≤500 mg)作为突击量，在30 min内快速静脉滴注，余量于23.5 h内泵，化疗期间予水化和碱化治疗，并对重要脏器进行保护治疗。在突击量MTX滴入后0.5～2 h内，给予1次化疗药物的鞘内注射：低危组鞘内注射二联药物(甲氨蝶呤、地塞米松)，中、高危组鞘内注射三联药物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松)。MTX滴注开始后42 h，予亚叶酸钙(CF)解救，剂量为每次15 mg/m2，每6 h解救1次，具体次数根据MTX血药浓度变化动态调整，直到MTX血药浓度<0.1 μmol/L。

1.3 MTX血药浓度测定 在HD-MTX化学治疗开始后的48 h，采集纳入研究患儿的静脉血2 ml，送至药理实验室，利用均相酶免疫分析法(EMIA)，用快速血药质量浓度测定仪检测MTX的血药浓度。若48 h的MTX血药浓度≥1 μmol/L，则可称为排泄延迟。

1.4 不良反应评价 首次HD-MTX治疗后7 d对不良反应进行统一评价,观察患儿是否出现骨髓抑制、肝肾功能损伤或其他不良反应，并按照美国卫生及公共服务部国立卫生研究院国家癌症研究所的不良事件常用术语评定标准(NCI-CTCAE V5.0),对化学治疗所致不良反应进行分级。若不良反应等级超过II级，则认为该化学治疗发生了不良反应。

1.5 基因型测定 在HD-MTX治疗前，用EDTA管采集外周静脉血2 ml用于基因检测。首先采用天根磁珠法血液基因组提取试剂盒提取DNA。设计特异性引物，用设计的引物进行特异性PCR扩增：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃链延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃补充延伸10 min。然后进行PCR产物鉴定：用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，与目的条带大小一致，进行Sanger测序。最后进行测序结果分析：用Chromas软件打开，与指定基因的特定位点进行对比得出结果。上述过程由北京智因东方医学研究中心有限公司协助完成。

1.6 统计学处理 本次研究应用SPSS 20.0统计软件处理研究数据，选择卡方检验或Fisher′s精确概率法分析组间的差异，进而比较ABCB1不同基因型患儿经过HD-MTX化学治疗后MTX血药浓度的差异及发生不良反应的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿一般资料 本研究共纳入ALL患儿132例，其中男78例，女54例，初诊时年龄为8周～16岁，中位年龄4岁，低危组患儿56例，中高危组患儿76例。野生型CC53例，杂合突变型CT25例，纯合突变型TT54例。应用Hardy-Weinberg对本研究所有纳入研究对象的基因型分布进行分析，提示本研究检测的ABCB1基因各基因型频率达到遗传平衡(P>0.05)。患儿的一般资料见表1。

表1 患儿一般资料

2.2ABCB1基因多态性与48 h MTX血药浓度的关系 见表2,结果显示,突变型TT型48 h MTX血药浓度更高，ABCB1基因多态性与HD-MTX化疗开始后48 h的MTX血药浓度间有相关性(P<0.05)，说明ABCB1基因多态性与ALL患儿HD-MTX化疗中MTX排汇延迟有关。

表2 ABCB1 基因多态性与化疗后48 h MTX血药浓度之间的关系

2.3ABCB1基因多态性与HD-MTX化疗不良反应的关系 本研究中共出现了15例HD-MTX相关的不良反应，其中白细胞减少7例，中性粒细胞减少1例，血红蛋白降低2例，肾功能异常5例，没有出现血小板减少及肝功能异常的病例。进一步分析ABCB1各基因型与HD-MTX化疗不良反应之间的相关性(见表3)，结果显示ABCB1各基因型患儿HD-MTX化疗所致各项不良反应例数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 ABCB1基因多态性与HD-MTX 化疗不良反应的关系

在急性淋巴细胞白血病的化学治疗中，不同危险度ALL的甲氨蝶呤使用剂量并不相同，低危患儿按照3 g/m2，中危及高危患儿按照5 g/m2。因此，本研究将纳入患儿分成低危组和中、高危组，并分别研究两组与HD-MTX化疗毒副作用的关系。低危组中，ABCB1各基因型CMTX>1.0 μmol/L例数比较差异有统计学意义(P<0.05),低危组以及中、高危组中，ABCB1各基因各患儿应用HD-MTX后各项不良反应例数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4、表5。

表4 低危组中ABCB1基因多态性与HD-MTX不良反应之间的关系

表5 中、高危组中ABCB1基因多态性与HD-MTX不良反应之间的关系

3 讨论

ALL是B淋巴细胞或T淋巴细胞在骨髓内异常增生导致的恶性肿瘤性疾病，病因与发病机制尚不明确，目前认为该病与家族遗传因素、环境因素(化学物质辐射、电离辐射、核辐射)、染色体数目和结构异常等有关，使骨髓内的原始细胞异常增生，增生的细胞没有正常的细胞功能，在骨髓中抑制骨髓正常的造血功能，并抑制正常的造血，从而出现贫血、出血、感染等一系列临床症状[4]。ALL多起病急骤，发病迅速，因此在治疗中格外注重快速有效。

临床上儿童ALL主要借助化学治疗，随着医疗水平及诊疗技术的快速发展，其5年无事件生存率(Event-free survival，EFS)逐渐升高，现已达到90%以上[5]。MTX是临床治疗ALL的关键性药物之一。

MTX的疗效与药物不良反应在临床治疗中存在个体差异。不同患者在接受相同剂量的MTX治疗时，表现出不同的不良反应，目前认为，这种临床差异与药物吸收、代谢、转运的基因序列改变有关[6]。

MTX通过ATP结合盒转运体家族从细胞中排出,其中ABCB1在这个过程中发挥了重要作用。ABCB1基因位于人类第7号染色体长臂(7q21.1)，编码p-糖蛋白(P-gp)。P-gp广泛分布在与分泌、排泄相关的组织及器官中，如肠道、肝肾等，在P-gp中包含ATP结合区，当ATP与ATP结合区结合、水解时，则可产生能量，为MTX排出细胞的过程供能，从而减少有毒物质对细胞的损害。

ABCB1C3435T位点的基因多态性是由于发生C/T碱基替代所导致的，该突变是同义突变，不会导致其编码的氨基酸发生改变，但可能导致编码的P-gp结构发生改变，进而影响到其功能，导致MTX排出延迟，使发生不良反应的可能性增高[7-8]。

有研究表明,ABCB1C3435T位点的突变基因T等位基因影响ABCB1基因的表达、产物的功能以及代谢[9]。本研究分析了132例ALL患儿ABCB1C3435T位点基因型与HD-MTX化疗后产生的不良反应及MTX血药浓度的关系，结果提示，ABCB1C3435T基因多态性与HD-MTX化疗开始后48 h的MTX血药浓度之间有相关性，突变型TT型48 hMTX血药浓度更高，这与朱影[10]等得出的结论一致。Ramírez-Pacheco等[11]等对墨西哥儿童进行的研究也得到了相似结论，结果显示，CC型患儿出现血浆中高MTX浓度和白细胞减少的风险较低。但是刘思婷等[12]的研究未发现ABCB1基因多态性与MTX排泄延迟具有相关性。王淑梅等[13]的研究也未发现两者间有相关性。在本研究中，杂合突变型CT型相比于纯合野生型CC型48 hMTX血药浓度更低，考虑到本研究中杂合突变型CT型只有25例，显著少于另外两种基因里，样本量少可能干扰研究结果。

另外在ALL的治疗中，不同危险度分级的患者应用MTX的剂量不同，本研究进一步分析了不同危险度中ABCB1C3435T位点基因型与化疗后MTX血药浓度的关系，得到在低危组中两者之间有相关性，而中、高危组中两者间未见相关性。这可能由于中、高危ALL患儿应用MTX的剂量大，化疗后MTX血药浓度高，产生的药物毒性大，而ABCB1C3435T位点基因多态性对药物代谢的影响力有限，使其与MTX排出延迟的相关性小。

在有关HD-MTX化疗后产生的不良反应如骨髓抑制、肾功能异常等方面，本研究发现ABCB1各基因型之间例数比较差异无统计学意义(P>0.05)。Lopez-Lopez[14]等对西班牙的ALL儿童进行研究得到相似结论，认为ABCB1基因多态性与各种不良反应及血浆药物浓度无明显相关性。但是一项对黎巴嫩患者的研究[15]得到的结论是中性粒细胞减少与ABCB1基因多态性之间存在显著的统计学关联。Gregers[16]等也认为该基因突变与MTX在儿童ALL治疗中的疗效和毒性之间存在相关性。Samara等[17]的研究认为肝脏损害与ABCB1基因多态性之间显著相关。本研究中未发现肝功能异常病例，出现其他不良反应病例同样较少，这可能导致本研究结果与其他研究结果不一致。随着治疗水平的日益提高，药物治疗越来越个体化、安全化、及时化，在化学治疗的同时，会给予充足的水化碱化加速MTX代谢及排出[18]，给予保肝、止吐等药物支持治疗，这可能是导致不良反应较少的原因，此外，本研究样本量小，也可能影响研究结果。

4 结论

本研究认为，ABCB1C3435T位点基因多态性与儿童ALL HD-MTX化学治疗后的MTX血药浓度之间具有相关性，而与HD-MTX化疗所产生的各种不良反应不相关。本研究的不良反应例数较少，这可能与化疗的同时应用水化碱化、保肝、止吐等辅助治疗有关，此外，联合其他化疗药物等其他因素都有可能造成干扰，可以通过扩大样本量进一步分析其他MTX代谢相关酶的基因多态性联合作用等因素，为临床个体化治疗提供更为可靠的依据。