风轮菜总黄酮联合miR-702-5p抑制物对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

张 宁，马 竞，武国利

0 引言

缺血后再灌注是急性心肌梗死、缺血性心肌病等重要治疗手段，而缺血再灌注引起的心肌细胞损伤严重阻碍了其疗效[1-2]。因此，减少或抑制缺血再灌注损伤对临床治疗相关心血管疾病具有重要意义。研究表明，中药治疗心肌缺血再灌注损伤疗效显著，可通过抗氧自由基损伤、抗脂质过氧化作用、减少炎性细胞浸润、抑制心肌细胞凋亡等保护心肌细胞损伤[3-5]。风轮菜是唇形科风轮菜属植物，黄酮是其主要活性成分，风轮菜活性部位具有抗氧化、保护内皮细胞的作用[6-7]。研究显示，miRNA在心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要作用，可作为诊断心血管疾病的敏感生物标志物[8]。如抑制miR-30c-2-3p可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤[9]。在自噬性心肌保护中，Notch1信号通路中miR-702-5p差异表达，其可能在自噬性心肌保护中发挥重要作用[10]。本实验通过建立缺氧/复氧心肌细胞模型，研究风轮菜总黄酮联合miR-702-5p对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌细胞H9c2购自美国ATCC细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购自北京天恩泽生物技术有限公司；二辛可宁酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自上海羽朵生物科技有限公司；P21(货号：bs-10129R-1)、Caspase-3抗体(货号：bs-0081R-1)购自上海恒斐生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP(货号：F030212-EBU)购自北京百奥莱博科技有限公司；细胞计数试剂盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)购自杭州仟诺生物科技有限公司；Annerxin V/FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京博迈斯科技发展有限公司；MDA、LDH、CAT、SOD检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京麦瑞博生物科技有限公司。

1.2 风轮菜总黄酮的制备 风轮菜购自本地中草药店，经本院中西医结合科主任路克文医师鉴定为风轮菜，取其茎叶洗净，干燥至恒重后粉碎，取20 g加入适量90%乙醇，超声波提取风轮菜总黄酮，得萃取液，过滤后收集滤液，测定浓度后稀释至所需浓度备用。

1.3 细胞培养与缺氧/复氧(H/R)模型建立 心肌细胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱培养，取对数生长期细胞先在95%N2、5%CO2的培养箱缺氧培养6 h，然后复氧3 h，更换培养基在正常条件下培养，建立H/R模型，对照组(Con)一直在常规条件下培养。

1.4 细胞处理与分组 分别用浓度为0、1.563、3.125、6.250、9.375、12.500、18.750、25.000、28.125、31.250 μg/ml的风轮菜总黄酮处理H9c2细胞12 h，然后换正常培养基培养，以检测风轮菜总黄酮对心肌细胞的毒性作用。

分别用浓度为6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml的风轮菜总黄酮处理H9c2细胞12 h，然后按照1.3中方法进行缺氧/复氧处理，分别记为H/R+药物-1组、H/R+药物-2组、H/R+药物-3组；将anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分别转染至H9c2细胞中进行缺氧/复氧处理，记为H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-702-5p组；将anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分别转染至H9c2细胞后，用25 μg/ml风轮菜总黄酮处理12 h，再进行缺氧/复氧处理，分别记为H/R+药物-3+anti-miR-NC组、H/R+药物-3+anti-miR-702-5p组。anti-miR-NC序列：CGAGGGTCTGGCAAGGAGGGA；anti-miR-702-5p序列：GAGCGGGGTAAAGGGTGGGCA。

1.5 Western blot检测P21、Caspase-3蛋白表达 提取细胞总蛋白并用BCA试剂盒进行定量。取50 μl蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF，牛血清蛋白封闭1 h。加入一抗P21(1∶800)、Caspase-3(1∶800)，4 ℃过夜，加入二抗山羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)室温培养1 h，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析各蛋白条带的灰度水平，蛋白表达水平=目的条带和GAPDH条带的比值。每个蛋白样品设3个重复，实验重复3次。

1.6 CCK-8检测细胞存活率 各组培养48 h的细胞，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞490 nm波长处的吸光度值(OD)。细胞存活率(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后,用预冷的PBS漂洗2次，与500 μl的结合缓冲液混匀。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.8 试剂盒检测MDA含量及LDH、CAT、SOD活性 细胞培养48 h后,收集各组细胞及细胞培养上清液，按试剂盒说明书进行操作。

1.9 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-702-5p表达水平 各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，反转录成cDNA，miR-702-5p以U6为内参进行PCR扩增，循环条件为95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-702-5p上游引物序列：5′-TCGGCAGGGAGCGGGGTA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。

2 结果

2.1 风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响 用不同浓度的风轮菜总黄酮处理心肌细胞，结果显示，各浓度风轮菜总黄酮处理的心肌细胞的存活率无显著差异，说明风轮菜总黄酮对正常心肌细胞无毒性(表1)。

表1 风轮菜总黄酮对心肌细胞存活率的影响

与对照组相比，H/R组miR-702-5p表达水平升高，P21、Caspase-3表达水平升高，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高(P<0.05)；与H/R组相比，各浓度风轮菜总黄酮处理组miR-702-5p表达水平降低，P21、Caspase-3表达水平降低，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低(P<0.05)(图1，表2)。

表2 风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

图1 风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表达的影响注：A.风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响；B.P21、Caspase-3蛋白的表达

2.2 风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞中LDH、MDA、CAT、SOD表达的影响 与对照组相比，H/R组MDA含量升高，LDH活性升高，CAT、SOD活性降低(P<0.05)；与H/R组相比，各浓度风轮菜总黄酮处理组MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞中LDH、MDA、CAT、SOD表达的影响

2.3 干扰miR-702-5p的转染效率 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-702-5p组miR-702-5p表达水平显著降低(P<0.05)(表4)。

表4 miR-702-5p的表达

2.4 干扰miR-702-5p表达联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响 H/R+anti-miR-NC组相比，H/R+anti-miR-702-5p组和H/R+药物-3+anti-miR-NC组P21、Caspase-3表达水平降低，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低(P<0.05)；与H/R+anti-miR-702-5p组和H/R+药物-3+anti-miR-NC组相比，H/R+药物-3+anti-miR-702-5p组P21、Caspase-3表达水平显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)(图2，表5)。

表5 干扰miR-702-5p联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

图2 干扰miR-702-5p联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表达的影响注：A.干扰miR-702-5p联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响；B.P21、Caspase-3蛋白的表达

2.5 干扰miR-702-5p联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞中LDH、MDA、CAT、SOD表达的影响 与H/R+anti-miR-NC组相比，H/R+anti-miR-702-5p组和H/R+药物-3+anti-miR-NC组MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)；与H/R+anti-miR-702-5p组和H/R+药物-3+anti-miR-NC组相比，H/R+药物-3+anti-miR-702-5p组MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表6)。

表6 过表达、干扰miR-702-5p联合风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞中LDH、MDA、CAT、SOD表达的影响

3 讨论

大量氧自由基的产生是缺血再灌注损伤的重要病理机制之一，而中药具有抗心肌缺血再灌注后氧化应激损伤的作用[11-14]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)脂质过氧化终产物含量可反映机体损伤程度；过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是机体清除自由基的酶，有抗氧化作用[15]。乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是糖无氧代谢的关键酶，细胞膜受损时，LDH可漏出细胞外，因此，检测细胞培养液中LDH的活性可间接反映细胞受损程度[16]。本研究结果显示，不同浓度风轮菜总黄酮预处理后，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中P21、Caspase-3表达水平降低，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。说明风轮菜总黄酮可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激及细胞凋亡；风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞具有显著保护作用。

研究表明，miRNA与应激反应、细胞凋亡有关，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[17]。敲低心肌细胞miR-497可改善缺氧/复氧心肌细胞损伤[18]。miR-214可减轻心肌缺血再灌注导致的心肌损伤[19]。本研究结果显示，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中miR-702-5p表达水平显著升高，提示miR-702-5p可能与缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤有关。本实验通过转染miR-702-5p的干扰表达载体，研究抑制miR-702-5p表达是否对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用，结果显示，抑制miR-702-5p表达后，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中P21、Caspase-3表达水平降低，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。说明抑制miR-702-5p表达可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。

本实验结果显示，与单独转染miR-702-5p干扰表达载体或单独用风轮菜总黄酮处理，细胞凋亡率显著降低，氧化应激水平也显著降低。表明两者联合作用对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用更显著。同时本研究结果还显示，风轮菜总黄酮单独处理后，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中miR-702-5p表达水平显著降低，提示风轮菜总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用可能与降低miR-702-5p的表达有关。

综上所述，风轮菜总黄酮联合抑制miR-702-5p表达可保护缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。