左归丸对肾病综合征模型大鼠NF-κB和TNF-α表达的影响

李 嘉，李 想

0 引言

肾病综合征是由于肾小球毛细血管壁结构被破坏使滤过膜失去屏障作用而发生蛋白尿[1]、低蛋白血症[2]及高脂血症[3]的一组临床综合征。左归丸出自《景岳全书》第五十一卷，由熟地、山药、枸杞、山茱萸等八味滋阴中药组成，具有壮水之主，培左肾阴之功效。主治真阴肾水不足，渐至衰弱，津液枯涸之证。本方临床主要用于老年慢性支气管炎、高血压病、慢性肾炎等症[4]。本研究观察左归丸对阿霉素诱发大鼠肾病综合征的影响，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠85只，体重200～240 g，由辽宁长生生物有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 受试药物及试剂 左归丸，仲景宛西制药股份有限公司，批号：190805。醋酸泼尼松，郑州韩都药业集团有限公司，批号：1906052。三酰甘油(TG)测定试剂盒、总胆固醇(TC)测试盒均购于南京建成生物工程研究所。PBS磷酸缓冲盐，批号：20190327，北京Solarbio科技有限公司。伊红染色液，批号：718123，苏木素染色液，批号：718112，购于珠海贝索生物技术有限公司。DAB试剂盒，北京Solarbio科技有限公司。内源性过氧化物酶的阻断剂，批号：190625391h。生物素标记羊抗大鼠/兔IgG，批号：1906215396b。链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶，批号：1906215395c。柠檬酸缓冲盐，批号：19032604。福建迈新生物技术开发有限公司。二甲苯，批号：20190801。无水乙醇，批号：20191017，沈阳市新华试剂厂。肿瘤坏死因子-α(TNF -α)抗体，批号:08012887。兔抗鼠κ基因结合核因子-P65(NF-κB P65)抗体，批号:AE073025，购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 AU5800全自动生化分析仪，贝克曼库尔特公司。RM2 245切片机，德国(徕卡)生产。BX53光学显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司。YG-280KX烤片机，阳光神琦医用科技有限公司。YG-280KX摊长机，阳光神琦医用科技有限公司。DNM-9602G酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 实验方法[5]取体重200～240 g雄性Wistar大鼠85只，按体重随机分为6组，分别为空白对照组(10只)，模型对照组，左归丸低剂量组(1.62 g/kg)，左归丸中剂量组(3.24 g/kg)，左归丸高剂量组(6.48 g/kg)，醋酸泼尼松组(6.45 mg/kg)，每组15只。除空白对照组外，其余各组分别尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg。将阿霉素用生理盐水溶解，浓度为2 mg/ml。各组灌胃给药体积为10 ml/kg，空白对照组、模型对照组灌胃等体积的蒸馏水，连续给药12周。实验结束时收集24 h尿液，检测尿蛋白。末次给药1 h后，乙醚麻醉大鼠，腹主动脉取血，检测各组大鼠血清总TG、TC、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。采血后取肾脏，置于4%多聚甲酸溶液中固定24 h。采用HE染色检查肾脏病理变化，采用免疫组化技术检测各组大鼠肾脏NF-κB p65 及TNF-α的表达水平。免疫组化结果采用Image J软件进行灰度值分析。

2.3 实验结果

2.3.1 左归丸对肾病综合征模型肾功能的影响 由表1可见，模型对照组24 h尿蛋白水平高于空白对照组(P<0.01)；左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组和醋酸泼尼松组24 h尿蛋白水平低于模型对照组(P<0.01)。模型对照组血清BUN水平高于空白对照组(P<0.01)；醋酸泼尼松组血清BUN水平低于模型对照组(P<0.05)。模型对照组Scr水平高于空白对照组(P<0.01)；左归丸中剂量组、高剂量组和醋酸泼尼松组血肌酐低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)。

表1 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾功能的影响

2.3.2 左归丸对肾病综合征模型血脂的影响 由表2可见，模型对照组TC、TG略高于空白对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组相比，左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组和醋酸泼尼松组血清TC和TG略有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 左归丸对肾病综合征模型大鼠TC和TG的影响

2.3.3 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾脏组织结构的影响 HE结果显示，空白对照组大鼠的肾小球结构清晰，形态规则，细胞核圆整。与空白对照组相比，模型对照组大鼠的肾组织染色不均，肾间质有炎性细胞浸润，基膜和系膜增生、肾小管排列紊乱、肾小球肥大。与模型组相比，左归丸各治疗组和醋酸泼尼松组的肾组织病变明显减轻，HE染色均匀，肾间质炎性细胞浸润减轻，基膜和系膜增生较模型对照组缓解，见图1。

图1 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾组织的影响(400×)注：A.空白对照组;B.模型对照组;C.左归丸低剂量组;D.左归丸中剂量组;E.左归丸高剂量组;F.醋酸泼尼松组

2.3.4 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾组织NF-κB P65和TNF-α表达的影响 由表3可见，模型对照组NF-κB P65表达高于空白对照组(P<0.01)。左归丸高剂量组和醋酸泼尼松组NF-κB P65表达低于模型对照组(P<0.05)。模型对照组TNF-α表达高于空白对照组(P<0.01)。与模型对照组相比，左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组和醋酸泼尼松组TNF-α表达显著降低(P<0.05)，见图2、图3。

表3 各组大鼠NF-κB P65和TNF-α表达水平比较

图2 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾组织NF-κB P65表达(400×)注：A.空白对照组;B.模型对照组;C.左归丸低剂量组;D.左归丸中剂量组;E.左归丸高剂量组;F.醋酸泼尼松组

图3 左归丸对肾病综合征模型大鼠肾组织TNF-α表达(400×)注：A.空白对照组;B.模型对照组;C.左归丸低剂量组;D.左归丸中剂量组;E.左归丸高剂量组;F.醋酸泼尼松组

3 讨论

大量蛋白尿是肾病综合征患者最主要的临床表现，也是肾病综合征的最基本的病理机制[6]。正常肾小球滤过膜具有电荷屏障[4]和分子屏障[7]，肾小球毛细血管壁结构破坏导致蛋白尿[8]。本研究中左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组24 h尿蛋白较模型对照组显著降低，说明左归丸对阿霉素引起的肾小球毛细血管损伤具有保护作用，能够降低阿霉素肾病综合征大鼠模型24 h尿蛋白含量。血尿素氮是血浆中蛋白质代谢的终末产物，由肾小球滤过而排出体外，肾功能不全时，血尿素氮将升高[9]。当肾小球滤过率下降至正常的50%以下时，血尿素氮的浓度迅速升高[10]。间质性肾炎、肾小球肾炎和急慢性肾功能衰竭均可使血尿素氮增高。本研究中左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组血清尿素氮较模型对照组虽有所降低，但未见显著性差异，可能与血尿素氮是血浆中蛋白质代谢的终末产物有关。正常情况下血肌酐从肾小球滤出，可用作肾小球滤过功能的诊断指标[11]。当肾小球滤过功能减低时，血肌酐因潴留而增高[12]。本研究中左归丸中剂量组、高剂量组的血肌酐较模型对照组显著降低，说明左归丸可增强肾病综合征模型大鼠肾小球的滤出功能。肾病综合征引起高胆固醇和高三酰甘油血症浓度增加的原因目前尚未完全阐明，可能是由于肝脏合成脂蛋白增加，但是在周围循环中分解代谢障碍所致。本研究中左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组的血清TC和TG较模型对照组虽略有降低，但差异无统计学意义，说明左归丸对肾病综合征模型的脂代谢仅有较弱的干预作用。

阿霉素肾病综合征模型为目前公认的能够较好模拟人类肾病的模型，其表现非常接近临床的人类肾病综合征，其细胞模型能够较好地模拟肾小球足细胞的基本功能，因此广泛应用于肾病的病理机制研究[13]。有研究表明，单剂量注射5 mg/kg以上阿霉素可引起大鼠出现严重而持续的蛋白尿，导致局灶性节段式的肾小球硬化，并伴有肾小管间质纤维化以及炎性浸润[14]，造成中等程度的肾功能不全。本研究中，与模型组相比，左归丸各治疗组的肾组织病变明显缓解，基膜和系膜增生、肾间质炎性细胞浸润均有所减轻，说明左归丸对阿霉素引起的肾组织损伤具有一定的治疗作用。

肾小球毛细血管滤过膜的损伤和肾小球内压及血流量密切相关，肾小球内毛细血管压力增加，入球小动脉血浆流量下降和膜两侧静水压代偿性增高，此时单个肾小球滤过分数增高，出球端的蛋白浓度高于正常，使血浆蛋白经肾小球毛细血管壁的弥散增加[15]。熟地、山萸肉、牛膝有降血压作用，可改善微循环[16]。肾病综合征还存在高凝状态，山萸肉、牛膝能降低红细胞聚集指数，降低全血黏度，抑制血小板聚集抗血栓形成[17]。参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κB的调控，包括：TNF-α、IL-6、iNOS、COX2和趋化因子等[18]。有研究表明，左归丸显著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平，左归丸中熟地、山萸肉、杜仲、龟板胶可防止连续服用地塞米松后肾上腺皮质萎缩，能有效保护肾上腺皮质功能[19]。本研究中左归丸高剂量组肾组织NF-κB P65表达较模型对照组显著降低，左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组肾组织TNF-α表达较模型对照组显著降低，表明左归丸可能通过调节NF-κB信号通路产生减轻阿霉素引起肾组织损伤的作用。

综上所述，本研究结果表明，左归丸对阿霉素引起的大鼠肾病综合征模型具有治疗作用，该作用可能与其对NF-κB信号通路的调节有关。