S100A4和MMP-2表达与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系

刘伟,董耀,苗江雨,马建亭

结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素和多步骤的复杂过程，遗传、饮食习惯和环境等多方面因素参与，预后不良[1]。CRC发病早期临床表现不明显，部分患者仅出现消化不良、大便潜血及腹部不适感等，易被忽略。若患者出现腹部包块、腹痛、便血等明显症状，大部分为进展期，对患者的身体造成严重的伤害。因此，了解CRC发生发展及侵袭和转移的规律，寻找特异性分子靶点及靶向药物，改善预后，以及降低CRC发病率和病死率具有重要价值[2]。钙结合蛋白A4 (S100A4) 属于钙离子结合蛋白(S100)家族，其在多种肿瘤如骨肉瘤、胃癌、肾癌、乳腺癌及肺癌等中过表达，且与患者不良预后关系紧密[3-4]，但目前关于CRC与S100A4研究甚少。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是基质金属蛋白酶家族成员之一， 其在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用[5-6]。现分析S100A4和MMP-2表达与CRC患者临床/病理特征和预后关系，旨在为临床诊断、治疗及判断患者预后提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年5月—2019年5月石家庄市第三医院普外科行结直肠癌根治术后患者152例，取其保存的石蜡标本作为研究对象(观察组)，其中男81例(53.3%)，女71例(46.7%)，年龄52.8～65.6(59.8±5.5)岁；病变部位：结肠85例(55.9%)，直肠67例(44.1%)；组织学类型：乳头状腺癌62例(40.8%)，管状腺癌44例(28.9%)，黏液腺癌46例(30.3%)；分化程度：高分化30例(19.8%)，中分化87例(57.2%)，低分化35例(23.0%)；淋巴结转移63例(41.4%)。以距肿瘤>5 cm的癌旁正常结直肠黏膜组织的石蜡标本50例作为对照组。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 组织中S100A4和MMP-2蛋白表达检测：病变组织脱蜡与水化之后，于室温下孵育、漂洗、甩干等过程，苏木素复染细胞核，时间约2 min，盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，采用已知阳性片(天津市津脉基因测绘技术有限公司)作为阳性对照。严格依据S-P免疫组织化学染色试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)说明书标准检测。

结果判定：S100A4蛋白和MMP-2蛋白均在细胞质内表达，于400倍显微镜(奥林巴斯CX23)下观察。 每张切片随机选10个高倍视野，观察阳性细胞百分率与染色强度。评价标准参考文献[7-8]：(1)阳性细胞百分率评分：未见阳性细胞记0分，阳性细胞<25%记1分，阳性细胞25%～75%记2分，阳性细胞>75%记3分。(2)显色评分：细胞胞质不显色或者显色不清记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。阳性评定结果为上述2项评分相加：阴性(-)0～1分，弱阳性(+)2～3分，中度阳性(++)4～5分，强阳性(+++)>5分。

1.2.2 血清CEA、CA199检测：术前1周采集患者静脉血2～5 ml，离心分离血清，以 UniCel DxI800全自动免疫分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，采用电化学发光法检测血清CEA和CA199水平。

2 结 果

2.1 2组组织中S100A4、MMP-2蛋白阳性表达率比较 观察组 S100A4和MMP-2蛋白阳性表达率分别为61.8%、84.9%，显著高于对照组的0、18.0%，2组比较差异有统计学意义(χ2/P=57.834/<0.001、77.723/<0.001)，见图1。

2.2 2组血清CEA、CA199水平比较 观察组血清CEA、CA199水平高于对照组,差异有统计学意义(P均<0.01)，见表1。

表1 2组血清CEA、CA199水平比较

2.3 不同临床/病理特征中S100A4、MMP-2蛋白阳性表达率比较 S100A4、MMP-2蛋白阳性表达率在不同性别、年龄、部位、临床分型、临床分期、组织学类型患者中比较差异无统计学意义(P>0.05)，而二者在有淋巴结转移患者高于无淋巴结转移患者，分化程度中低分化患者高于高分化患者(P均<0.01)，见表2。

表2 S100A4、MMP-2蛋白阳性表达率在不同临床/病理特征中比较 [例(%)]

2.4 不同S100A4和MMP-2蛋白表达的CRC患者生存率比较 所有患者进行随访，随访截止时间为2020年4月25日， S100A4、 MMP-2蛋白阳性表达的CRC患者5年生存率分别为51.1%、55.8%，阴性表达患者5年生存率分别为77.6%、78.3%，S100A4、MMP-2阳性表达者5年生存率显著低于阴性表达患者，差异均有统计学意义(χ2/P=10.624/0.046、4.072/0.037)，见图2。

图2 不同S100A4、MMP-2蛋白表达结直肠癌患者生存曲线

3 讨 论

S100A4属于钙离子结合蛋白家族成员，被认为是钙传感器蛋白的一类，是由肿瘤细胞和肿瘤活化的间质细胞分泌的活性肿瘤转移调节因子[9-12]。已有文献报道有关S100A4蛋白与结直肠癌发生发展关系的相关研究。有学者利用免疫组化技术对180例结直肠癌组织中的S100A4蛋白表达情况进行检测,其结果为16%高表达, 31%低表达, 53%无表达, 并且S100A4蛋白的表达是判断结直肠癌患者预后的一个独立影响因子(P<0.01)[13]。 另有研究者利用免疫组化技术对124例结直肠癌患者进行病理检查，并进行染色分析操作,结果表明，S100A4蛋白在正常结直肠黏膜上皮中无表达或弱表达；在结直肠癌组织中70例(56.5%)呈阳性表达, 43例(34.7%)存在淋巴结转移现象，统计学分析显示S100A4蛋白的表达与肿瘤分期及淋巴结转移密切相关，但与肿瘤的位置和大小无关[14]。研究表明，S100A4蛋白表达与患者的临床预后呈负相关，利用对S100A4蛋白表达状态的检测，可以辅助判断结直肠癌患者的预后[15]。

S100A4蛋白的高表达和结直肠癌 Dukes分期、淋巴结转移和生存期具有极为紧密的联系。本结果显示，S100A4蛋白与结直肠癌的组织分化程度、淋巴转移密切相关，与患者的预后水平及效果等呈负相关。其主要原因可能为：S100A4能够较大程度减少肿瘤细胞之间存在的黏附力。根据相关研究可知，上皮钙黏蛋白属于一种重要的细胞黏附分子，有效且适当地调节患者体内的钙离子依赖性细胞黏附力，进一步对人体正常细胞间的黏附性进行有效的维持[16-21]。有研究表明，S100A4蛋白和上皮钙黏蛋白的表达之间始终呈负相关[22]。肿瘤组织中存在大量的S100A4蛋白表达，从而造成患者机体内上皮钙黏蛋白的表达处于持续降低状态，最终加快了肿瘤细胞在肿瘤部位的脱落进程。S100A4在结直肠癌浸润转移中的分子机制及作用途径尚不清楚[23-25]。本结果显示，观察组S100A4蛋白阳性表达率高于对照组，淋巴结转移者S100A4蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移者，中分化和低分化S100A4蛋白阳性表达率高于高分化，提示S100A4蛋白在结直肠癌组织中高表达，且随着病情的进展和转移表达逐渐升高；S100A4阳性表达患者5年生存率低于阴性表达患者，提示S100A4阳性表达越高预后越差。上述结果均显示，在发生细胞癌变后，机体会产生大量的S100A4蛋白。分期越晚，或发生转移的结直肠癌分泌S100A4蛋白的水平就越高，说明S100A4蛋白在结直肠癌的进展及转移过程有着重要的作用。

研究表明，S100A4蛋白能够有效地将细胞外基质进行降解及重构,进一步促进机体内肿瘤细胞移行,为恶性肿瘤的侵袭及转移创造适宜条件,同时S100A4蛋白与MMP-2表达具有比较密切的关系；S100A4利用对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)的改变和黏附于细胞膜上的膜型基质蛋白酶1(MT1-MMP)进行有效结合，从而促进MMP-2酶原被激活[26]。另外研究表明, S100A4可激活NF-κB通路、促进MMP-2的合成。

综上所述，S100A4和MMP-2在结直肠癌组织中表达明显高于正常结直肠黏膜组织，且随着结直肠癌病情发展表达升高，阳性表达越高预后越差，可作为判断结直肠癌患者病情和预后的指标，为进一步的研究及临床治疗提供了可靠的病理学依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘伟：课题设计和实施，分析、解释数据，文章撰写，统计分析；董耀：课题设计，文章修改，技术或材料支持；苗江雨：实施研究，采集数据，统计分析；马建亭：选题思路，课题设计，文章审阅、指导