miR-125b在病毒性脑炎患儿中的表达水平及其与Th17/Treg平衡及预后的关系

朱莉，姜远安，肖冠华，何志毅，李君军

病毒性脑炎是中枢神经系统常见的一种疾病，伴有脑实质炎性反应，病因复杂多样，主要是脑实质或脑膜被各种病毒入侵后所引起的一种感染性疾病，通常与机体的免疫功能低下有关[1-3]。 据统计，儿童病毒性脑炎的发病率从3.5/10万～7.4/10万上升到了16/10万[4]。不同病情的病毒性脑炎患儿预后也不同，严重者可能出现不同程度的发育迟缓、肢体瘫痪甚至死亡[5]。因此，早期识别不良预后的患儿，可以帮助医生采取更有效的治疗措施来改善患儿预后情况，但现在临床上仍然缺乏预测不良预后的敏感生物学指标。近年研究显示，微小RNA(microRNA，miR)在调节细胞发育和功能中起关键作用，多种miR可用作疾病预后的生物标志物[6-7]。据报道，miR-125b与炎性疾病的发展及T细胞分化有关，与机体的免疫功能密切相关，在神经系统肿瘤中有一定的诊断价值[8]。miR-125b是否通过T细胞分化影响病毒性脑炎的病理过程尚不清楚，与病毒性脑炎患儿预后的关系也未见报道，因此本研究通过测定病毒性脑炎儿童血浆miR-125b水平，分析miR-125b与机体辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的关系，并探讨影响病毒性脑炎患儿不良预后的危险因素，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2019年11月湖南省郴州市第一人民医院儿童危重症科收治病毒性脑炎患儿110例为脑炎组，其中男72例，女38例，年龄1～12 (4.25±2.74)岁；住院时间7～38(23.42±13.83)d；临床症状：发热92例，头痛46例，有意识改变56例，存在惊厥持续状态34例，伴有应激性高血糖35例；致病病毒：肠道病毒78例，巨细胞病毒16例，EB病毒11例，单纯疱疹病毒1型3例，单纯疱疹病毒2型2例。选取同期体检健康儿童100例为健康对照组，男68例，女32例，年龄1～12(4.84±2.82)岁。2组对象的性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者家属或其监护人知情同意，并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①病毒性脑炎患儿诊断符合国际脑炎联合会儿童病毒性脑炎的诊断标准[9]；②相关实验室检查和影像学检查资料完整；③年龄<14岁。(2)排除标准：①合并其他细菌感染；②合并免疫系统疾病；③存在肝肾功能异常；④近期使用过糖皮质激素和免疫抑制剂等药物。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血浆标本采集：患儿于确诊次日清晨/健康儿童于体检当日空腹采集肘静脉血6 ml， 并储存在含有肝素钠的抗凝剂管中， 2 ml用于流式细胞术，4 ml于4℃离心，将血浆移至新EP管中，在-80℃超低温冰箱储存用于检测血浆miR-125b水平和炎性因子水平。

1.3.2 实时定量PCR检测血浆miR-125b水平：使用血浆RNA提取试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司)提取总RNA，使用逆转录试剂盒(广州易锦生物技术有限公司)将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR。miR-125b正向引物序列：5'-GATCTGCAGCTCTCCCAGGGGCTGGCTTCAG-3'，反向引物序列：5'-GATCATATGGAGGCAGAAAGGATGGAGAAGT-3'；U6作为内参，其正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。实时定量PCR反应体系总体积为20 μl，反应体系包括：SYBR Green染料、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、ddH2O；反应条件：94 ℃ 1 min预变性，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，连续40个循环。每个样本设置3个复孔，miR-125b的表达水平用2-△△Ct表示。

1.3.3 Th17和Treg细胞检测：上述血液2 ml使用流式细胞术检测Th17和Treg细胞，使用PBS缓冲液将血细胞稀释至8 ml，加入到人淋巴细胞分离液的界面上， 于4℃时离心获得血清，使用PBS缓冲液洗涤2次，使用流式细胞仪(艾森生物NovoCyte)检测Th17和Treg，计算Th17/Treg比值。

1.3.4 血浆炎性因子检测：使用酶联免疫吸附试验检测白介素17(IL-17)、IL-6、IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)水平，试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，操作严格按照说明书进行。

1.3.5 预后判断： 随访6个月，收集相关信息，使用儿童格拉斯哥预后量表(GOS)[10]评估病毒性脑炎患儿预后。GOS 1级：死亡；GOS 2级：植物状态；GOS 3级：日常生活学习无法自理，需要照料，严重残疾；GOS 4级：日常生活学习可独立，轻度残疾；GOS 5级：恢复良好，日常生活学习可自理，正常活动。将GOS评级1～3级划分为预后差亚组， 4～5级为预后良好亚组。

2 结 果

2.1 2组血浆miR-125b、Th17、Treg和Th17/Treg比值比较 脑炎组患儿血浆miR-125b、Th17水平和Th17/Treg比值显著高于健康对照组，Treg水平显著低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 2组受试者血浆miR-125b、Th17、

2.2 2组炎性细胞因子比较 脑炎组患儿血浆IL-17和IL-6水平均高于健康对照组，IL-10和TGF-β水平均低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组受试者血浆IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比较

2.3 不同预后患儿临床资料比较 110例病毒性脑炎患儿中，预后良好72例(65.45%)，预后不良38例(34.55%)。 预后良好亚组和预后不良亚组患儿的意识改变、惊厥持续状态、是否有应激性高血糖、脑CT异常、脑MR异常、血浆miR-125b、Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。不同预后患儿的性别、年龄、发热和头痛比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同预后患儿临床资料比较 [例

2.4 miR-125b、Th17/Treg、炎性因子与预后的相关性 脑炎组患儿血浆miR-125b水平与IL-17、IL-6、Th17/Treg及预后均呈正相关(r/P=0.810/0.000、0.689/0.004、0.778/0.000、0.793/0.000)，与IL-10和TGF-β水平均呈负相关(r/P=-0.797/0.000、-0.748/0.000)；脑炎组患儿血浆Th17/Treg与IL-17、IL-6及预后均呈正相关(r/P=0.873/0.000、0.701/0.004、0.878/0.000)，与IL-10和TGF-β水平均呈负相关(r/P=-0.644/0.018、-0.796/0.000)。

2.5 病毒性脑炎预后多因素Logistic回归分析 将上述结果中有统计学意义的指标纳入多因素Logistic回归分析，其中因变量为病毒性脑炎患儿预后(1=不良，0=良好)，自变量为意识改变(1=有，0=无)，惊厥持续状态(1=有，0=无)，脑CT异常(1=有，0=无)，脑MR异常(1=有，0=无)，应激性高血糖(1=有，0=无)，血浆miR-125b(实际值)，Th17/Treg比值(实际值)、IL-17(实际值)、IL-6(实际值)、IL-10(实际值)和TGF-β(实际值)。结果显示，有意识改变、有惊厥持续状态、脑CT异常、脑MR异常、有应激性高血糖、血浆miR-125b水平升高是病毒性脑炎患儿预后的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 病毒性脑炎患儿预后多因素分析

3 讨 论

儿童病毒性脑炎是儿科的常见病，会引起脑组织水肿、坏死、脑功能损害等病理改变，临床表现为发热、呕吐、头痛、意识改变、抽搐、癫痫发作和局灶性神经功能缺失等症状，严重影响儿童的生活质量和生命健康。当儿童抵抗力降低时，病毒可以侵入中枢神经系统，引起脑实质炎性反应[11]。T细胞是人体重要的免疫细胞，主要分为Treg、Th和细胞毒性T细胞[12]。Th17是新发现的CD4+T细胞亚群，与Treg在功能上相互抑制，二者在体内的动态平衡状态在维持机体免疫稳态中发挥重要作用，Th17/Treg失衡可导致感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的发生[13-14]。

本结果发现，病毒性脑炎患儿血浆Th17水平和Th17/Treg比值高于健康对照组，Treg水平低于健康对照组，说明病毒性脑炎患儿体内出现Th17细胞活化，Treg细胞抑制，从而出现Th17/Treg失衡，这一现象与既往研究中细胞感染病毒后，可以诱导Th17细胞活化，抑制Treg细胞活化的结论相吻合[15]。本结果显示，脑炎组患儿血浆IL-17和IL-6水平显著高于健康对照组，IL-10和TGF-β水平显著低于健康对照组，说明病毒性脑炎患儿体内出现了明显的炎性反应，这是因为Th17可以产生IL-17和IL-6等细胞因子，参与中性粒细胞的增殖、趋化和激活，导致细胞组织炎性损伤[16]。Treg主要分泌IL-10和TGF-β发挥免疫抑制作用，TGF-β通过反馈调节维持Treg数量和功能，同时还可以抑制效应T细胞的增殖和分化[16]。病毒性脑炎患儿体内Th17/Treg失衡，进而导致促炎性细胞因子(IL-17和IL-6)分泌增加，抗炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)分泌减少，导致脑组织炎性损伤加重，这些机制可能参与了儿童病毒性脑炎的病理过程。

miR是一种非编码单链RNA，可以与mRNA结合抑制mRNA的翻译过程，从而调节蛋白质的表达[6-7]，既往研究显示，miR-125b与炎性疾病的发展和机体的免疫功能密切相关[8]，本结果发现，脑炎组患儿血浆miR-125b水平显著高于健康对照组，说明miR-125b可能参与了病毒性脑炎的发生发展过程。本研究脑炎组患儿血浆miR-125b水平与IL-17、IL-6、Th17/Treg、预后均呈正相关，与IL-10和TGF-β水平均呈负相关，表明miR-125b可能是通过影响Th17/Treg的平衡状态，进而引起炎性因子释放紊乱，介导炎性反应发生来参与病毒性脑炎的发生发展过程和预后。miR-125b引起Th17/Treg失衡的机制可能与视黄酸相关的孤儿受体γt和转录因子Foxp3有关，目前有研究发现，miR-125b可以影响视黄酸相关的孤儿受体γt和转录因子Foxp3的表达，而视黄酸相关的孤儿受体γt在Th17分泌IL-17过程中起调节作用，转录因子Foxp3是Treg细胞的重要调节蛋白，调节Treg细胞的发育和功能[17]，因此miR-125b可能通过上述途径影响病毒性脑炎患儿机体内Th17/Treg的平衡，从而影响患儿的预后。

此外，本结果还发现，影响病毒性脑炎患儿预后的危险因素主要有意识改变、惊厥持续状态、脑CT异常、脑MR异常、应激性高血糖和血浆miR-125b水平升高。印澄莹等[18]的研究发现，意识改变的患者内侧前额叶、脑干和胼胝体的损伤较其他部位明显增高，脑MR也显示意识障碍患者的执行控制网络和默认模式网络的功能连接强度降低，与预后GCS评分有关。脑CT异常和脑MR异常直接或间接说明脑实质受损，病毒性脑炎MR表现为病灶广泛，可累及各个部位，出现弥漫性脑组织肿胀甚至病灶出血，累及范围越大，预后越差[19]。惊厥持续状态可以导致海马区神经元死亡，从而引起脑损伤，惊厥持续时间和次数都影响患儿的预后[20]。应激性高血糖通常伴有低钠血症和低钙血症，加速机体内环境稳态失调，导致疾病恶化，此外高血糖可以引发高渗血症，易引起意识障碍和抽搐[21]，从而影响患儿的预后。本结果还发现，血浆miR-125b水平升高也影响患儿的预后，这可能与miR-125b可引起视黄酸相关的孤儿受体γt和转录因子Foxp3表达，进而导致Th17/Treg失衡和炎性反应加重有关。

综上所述，miR-125b与机体的免疫状态密切相关，促进Th17/Treg失衡，参与病毒性脑炎的发病过程，此外，意识改变、惊厥持续状态、脑CT异常、脑MR异常、应激性高血糖和血浆miR-125b水平升高是影响病毒性脑炎患儿预后的危险因素。但miR-125b如何通过机体的免疫反应介导病毒性脑炎的病理过程，还需要进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

朱莉：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写;姜远安、肖冠华：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;何志毅：进行统计学分析；李君军：提出研究思路，分析试验数据，论文审核