Ⅰ型胶原蛋白生物膜在损伤肌腱内源性愈合过程中的作用

胡兴峰，李青松，季 亮，张博伟

(贵阳市第四人民医院骨三科，贵州 贵阳 550002)

肌腱是连接肌肉与骨，并传递由肌肉产生的力从而带动骨与关节活动的单轴致密纤维结缔组织[1]，在机体关节运动中起着极为重要的作用。肌腱损伤后往往导致患肢功能障碍甚至劳动力丧失，对患者生活质量产生严重影响。

近年来，关于如何促进损伤肌腱的再修复、提高肌腱愈合质量并最终恢复患者肢体功能的分子生物学水平研究较多[2]。Wu等[3]发现，通过基因转染方法可以有效提高肌腱愈合程度；Mao等[4]将血管内皮生长因子转染腺病毒载体后植入损伤肌腱，证实转染的基因可以提高肌腱自然愈合的能力，加速肌腱细胞增殖，促进肌腱愈合；还有学者发现，干细胞移植后可以被诱导向肌腱细胞分化，高表达肌腱标志物及Ⅰ型胶原蛋白，显著提高肌腱愈合质量[5-6]。以上研究均能促进肌腱愈合，但是都未能解决损伤肌腱术后粘连导致功能障碍的问题。因此，有研究尝试在损伤肌腱周围建立可降解的生物屏障以降低粘连发生率，取得较好效果[7]。目前报道的可用于防粘连的生物材料有五十余种[8]，且这些生物材料大多可被完全吸收，其作用机制是通过干扰肌腱外源性愈合，从而为损伤肌腱提供良好的生物屏障，达到预防粘连的效果[9]。然而可吸收医用防粘连材料在预防肌腱粘连的同时，是否在损伤肌腱内源性愈合过程也有促进作用，目前尚未见相关报道。本研究选择Ⅰ型胶原蛋白生物膜(以下简称生物膜)进行相关动物实验，探讨生物膜在肌腱内源性愈合过程中的作用，以期为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 16只健康SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量220 g左右，购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司。大鼠自由饮水、进食，于温度23～25 ℃动物房12 h/12 h昼夜交替适应性饲养1周后进行实验。实验过程中对动物的处理严格遵循《实验动物管理条例》(2017年)。本研究经贵阳市第四人民医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要仪器与试剂 电热恒温鼓风干燥箱(博讯，上海)，超净工作台(VS-1300，苏州)，Ⅰ型胶原蛋白生物膜(无锡贝迪生物，江苏)，倒置显微镜、照相系统(OLYMPUS，日本)，激光共聚焦荧光显微镜、切片机、展片机、烤片机(Leica，德国)，多聚甲醛(生工，上海)，苏木素染液(南京建成，江苏)，伊红染液(碧云天，上海)，中性树脂(国药集团，上海)。一抗：兔来源Anti Collagen I(博奥森，北京)，二抗：山羊抗兔Anti CY3(abcam，英国)。免疫荧光一抗稀释液(碧云天，上海)，免疫荧光二抗稀释液(碧云天，上海)，山羊血清(Hyclone，美国)，DAPI染色液(碧云天，上海)，抗荧光淬灭剂(碧云天，上海)。

1.2 大鼠损伤肌腱模型建立及分组

将16只大鼠分成实验组和对照组，每组8只。大鼠称重，7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉生效后常规备皮，75%酒精棉球消毒；沿跟腱位置纵向切开显露肌腱，切除腱鞘约1 cm，在腱性移行部至跟腱止点的中点处锐性横断。对照组在跟腱离断后，采用改良Kessler法缝合，用无菌PBS冲洗2～3次；实验组在跟腱离断，改良Kessler法缝合后，剪下2 cm×1 cm的生物膜包裹住跟腱缝合部位并使其与腱组织紧密贴合。2组大鼠术后局部注射青霉素抗感染，关闭手术切口，予以石膏外固定，隔日换药1次。

1.3 取材

分别于治疗后第1、2、3、4周取材，每组每次取2只大鼠，共4个样本。解剖显露手术区域，行大体观察，包括伤口皮肤颜色、温度、渗出及深部组织愈合情况等。进一步解剖损伤处跟腱组织，观察跟腱损伤处愈合及生物膜吸收情况。取损伤处肌腱组织，无菌PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，于4 ℃保存，用于后续实验检测。

1.4 HE染色观察

将组织分别浸泡在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ和100%乙醇Ⅱ中10 min进行脱水。将脱水后的组织分别浸泡在1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min进行透明。将透明处理的组织浸泡于融化的石蜡中3 h，进行包埋。用切片机将石蜡块中的组织切成5 μm薄片，并将其紧贴平铺于防脱玻片上，置于55 ℃烤片机上。将石蜡切片分别浸泡于1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min脱蜡，随后浸泡于100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中5 min。双蒸水清洗3次，每次2 min。切片苏木素染色10 min，自来水冲洗多余染色液约5 min，蒸馏水再洗涤1遍(数秒即可)。若苏木素着色过深则可用1%盐酸酒精脱去细胞质中多余的苏木素染色液。伊红染色30 s，自来水冲洗多余染液约3 min，蒸馏水再洗涤1遍。中性树脂封片。用光学显微镜观察炎性细胞、成纤维细胞和胶原纤维的分化情况，并进行分析。

1.5 免疫荧光检测Ⅰ型胶原蛋白表达

切片、脱蜡、复水同HE染色，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，于微波炉内加热，使容器内液体温度保持在92～98 ℃，保持10～15 min。取出容器，室温冷却10～20 min。PBS清洗，蒸馏水清洗，PBS浸泡5 min。在切片组织上滴加山羊血清，室温封闭60 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张切片组织滴加足够量的一抗Collagen I(1∶100)并放入湿盒，于4 ℃孵育过夜；取出湿盒，室温复温30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水纸吸干切片上多余液体后滴加荧光二抗CY3(1∶800)，湿盒中于37 ℃孵育60 min(注：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都在暗处进行)。PBS浸洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育15 min，对标本进行染核，PBS浸洗4次，每次5 min以洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。每6孔板中随机选择2孔，每孔5个视野进行拍照，并用Image J软件进行图像分析，计算细胞数。每个高倍视野下计算能够表达Ⅰ型胶原蛋白特性的细胞比例，并进行统计学分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 损伤肌腱标本大体观察

治疗后1周，实验组手术切口利用血管钳钝性分离显露深层组织，皮肤和周围组织可见水肿，肌腱修复区域愈合不牢，轻轻牵拉即可见组织分离，生物膜清晰可辨，并且较易与肌腱组织分开；对照组亦可见周围组织水肿，肌腱断端接触良好。治疗后2周，实验组手术切口愈合良好，需锐性切开显露，手术区域组织水肿表现不明显，生物膜与肌腱组织及肌腱断端联系紧密；对照组可见损伤肌腱处与周围组织轻微粘连，但轻微钝性分离即可分开。治疗后3周，实验组手术切口愈合，生物膜与肌腱组织联系致密，不能将其完整分开，并且生物膜出现液化降解现象，肌腱损伤处与周围组织界限清楚，肌腱活动较好；对照组损伤肌腱处可见与周围组织形成粘连带。治疗后4周，实验组见生物膜被降解吸收，损伤肌腱组织与周围组织有明显界限，肌腱活动不受限制；对照组肌腱损伤处与周围组织粘连带更加明显，肌腱活动较差。

2.2 损伤肌腱修复后组织学观察

治疗后1周，2组损伤肌腱组织周围出现大量淋巴细胞和少量嗜中性粒细胞，未见巨噬细胞，少量成纤维细胞聚集。随着时间延长，到第3～4周时，实验组术区生物膜外大量成纤维细胞聚集和瘢痕组织形成，膜内肌腱细胞胶原纤维沉积呈线性排列，方向一致，较为整齐，并见肌腱细胞长入生物膜内(图1)；而对照组损伤肌腱组织周围可见大量成纤维细胞及毛细血管向正常肌腱细胞浸润，与肌腱细胞融合，可见极少量嗜酸性粒细胞，胶原纤维排列紊乱，肌腱外源性愈合优势明显(图2)。

a：治疗后1周；b：治疗后2周；c：治疗后3周；d：治疗后4周

a：治疗后1周；b：治疗后2周；c：治疗后3周；d：治疗后4周

2.3 免疫荧光检测Ⅰ型胶原蛋白表达

免疫荧光结果显示，2组成熟新生肌腱细胞多表达Ⅰ型胶原，核被染成蓝色荧光，显微镜下观察可见荧光足够亮，并能实现照片曝光；随着治疗时间延长，2组Ⅰ型胶原蛋白的表达均增加，荧光能够稳定较长时间，且实验组Ⅰ型胶原蛋白表达高于对照组(P<0.05)，胶原纤维排列更加有序(图3、4)。

a：治疗后1周；b：治疗后2周；c：治疗后3周；d：治疗后4周

a：治疗后1周；b：治疗后2周；c：治疗后3周；d：治疗后4周

2.4 Ⅰ型胶原蛋白特性的细胞比例

治疗后2组表达Ⅰ型胶原蛋白特性的细胞比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 Ⅰ型胶原蛋白特性的细胞比例

3 讨论

肌腱损伤在创伤外科较为常见，损伤后肌腱愈合的质量直接影响到患者的肢体功能，肌腱愈合是由内源性和外源性共同作用的一个复杂过程[10]。其中，内源性愈合主要依靠肌腱细胞的增殖来完成修复，其修复过程属于同源性修复[11]；而外源性愈合则是通过周围组织的成纤维细胞和毛细血管增生完成修复，其修复过程属于非同源性修复，这也是外源性愈合最终导致肌腱粘连的原因[12]。

国内外学者尝试应用各种生物或者非生物材料作为损伤肌腱修复的物理屏障，预防肌腱术后粘连，这些材料大致可分为两大类，即以羊膜、胶原蛋白、壳聚糖为代表的天然生物材料类和以聚合物为代表的人工合成类。白江博等[13]发现新鲜羊膜对于早期肌腱修复更具有优势；然而Leppänen等[14]的研究发现，利用同种异体羊膜移植并不能有效提高肌腱的一期愈合效果，但也指出这可能与技术因素有关。另有研究发现，通过静电纺丝技术制备的电纺聚乳酸—羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原—聚己内酯双层膜具有组织相容性好、无毒等优点，可通过电纺聚乳酸—羟基乙酸共聚物抑制成纤维细胞生长、Ⅰ型胶原—聚己内酯促进肌腱细胞黏附存活，有效预防肌腱断裂后腱周粘连的发生[15]；另有研究报道这种多层电纺生物膜不但在预防肌腱粘连方面有优势，而且具有抗炎作用[16-17]。Yousefi等[18]利用纳米技术制备了一种新型纳米氧化锌(ZnO)纳米壳聚糖材料用于促进损伤肌腱修复，8周后材料被完全吸收，肌腱周围无炎症反应现象，粘连少。这些新型材料在肌腱愈合预防粘连方面均有良好的效果。本研究选用的生物膜是由2～3周岁黄牛跟腱经化学提取合成的高纯度的具有三维空间结构的Ⅰ型胶原，结果表明，实验组损伤肌腱与周围组织界限清楚，极少粘连，肌腱愈合质量明显高于对照组。说明使用Ⅰ型胶原蛋白生物膜能够有效阻止损伤肌腱的外源性愈合过程，并且生物膜能够充分被吸收，生物相容性好，可有效预防其术后粘连的发生。

胶原蛋白具有低免疫原性、高生物相容性和高组织降解性等特点[19]，是目前的研究热点。查朱青等[20]的研究发现，Ⅰ型牛胶原蛋白生物膜不仅可以有效减少粘连，还可以增强损伤肌腱愈合的生物力学特性；单海民等[21]的研究发现，Ⅰ型牛胶原蛋白生物膜安全有效，且在预防肌腱术后粘连方面有优势。近年来，胶原蛋白更是被作为一种天然的生物资源而广泛应用于医学领域生物材料的制作[22]。Müller等[23]认为Ⅰ型胶原蛋白海绵可促进损伤肌腱愈合，但未阐明具体机制；Rieu等[24]认为在组织工程方面，胶原蛋白支架在损伤肌腱修复及预防术后粘连上具有广阔的应用前景。肌腱损伤的愈合过程是多因素共同作用的结果，随着研究的深入，不仅有新的治疗方法报道，研究者们也从以往的单纯阻止肌腱外源性愈合过程到现在如何同时促进损伤肌腱内源性愈合过程方向发展，更加关注于肌腱愈合的质量和肢体的功能恢复[25]。本研究选择Ⅰ型胶原蛋白生物膜进行相关动物实验，初步验证了生物膜对损伤肌腱内源性愈合起到了促进作用。免疫荧光检测能够对肌腱内源性愈合过程中起主要作用的Ⅰ型胶原蛋白进行标记追踪，直观反映出生物膜在损伤肌腱内源性愈合过程中起到的作用。本研究免疫荧光结果表明，2组Ⅰ型胶原蛋白的表达均增加，荧光能够稳定较长时间，且实验组Ⅰ型胶原蛋白表达高于对照组，胶原纤维排列更加有序，这为以后对生物膜促进损伤肌腱内源性愈合过程的具体作用机制的研究提供新的方向。

综上所述，Ⅰ型胶原蛋白生物膜材料在损伤肌腱内源性愈合过程中有明显促进作用。