尿miR-128a和miR-28-3p联合检测在前列腺癌诊断和预后中的价值

袁海川 宋武 顾朝辉 李连红 罗程鹏 徐可

前列腺癌是常见的恶性肿瘤，在我国其发病率呈逐年增高的趋势，并发现高雄性激素或者雌性激素受体敏感性改变着，其发病率更高，严重威胁患者的生命，影响患者的生活质量，因此早期诊断前列腺癌是提高和延长术后生存期的关键[1]。微小RNA(miR)是长度为19-25核苷酸的RNA，在真核细胞中是一类具有调节功能的非编码RNA，其参与了肿瘤的发生发展中具有重要作用，并作为诊断和判断预后的肿瘤标记物[2,3]。现常用的标本为组织标本，虽然准确度较高，但获取标本为有创性，患者的依从性较差[4]。现已经证实尿液也是重要的标本库，尤其在膀胱癌、前列腺癌和肾癌中的诊断具有优势[5,6]。本研究通过尿液检测miR-128a和miR-28-3p水平，观察其在诊断前列腺癌和预测预后中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月至2016年12月在仁和医院和复旦大学附属华山医院就诊确诊的前列腺癌患者尿液标本117例，为前列腺癌组。年龄45～85岁，平均年龄(62.34±10.65)岁；前列腺癌特异性抗原(PSA)≥10 ng/L 38例，<10 ng/L 79例；Gleason评分≥7分77例，<7例40例；肿瘤直径≥3 cm 54例，<3 cm 63例。选择同期诊断为前列腺良性增生患者的尿液标本75例，为前列腺良性增生组，其中年龄45～83岁，平均年龄(62.76±6.82)岁；选择同期行健康体检者尿液30例，为健康对照组，年龄45～80岁，平均年龄(62.19±7.15)岁。3组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：均行手术治疗，病理确诊为前列腺癌；所有的患者术前未行放疗、化疗和免疫治疗等；均经伦理委员会审核通过。

1.2.2 排除标准：其他脏器的恶性肿瘤；临床资料不完整，无法进行统计分析的患者；已行放疗、化疗和免疫治疗的患者。

1.3 方法

1.3.1 尿液标本的保存:患者入院时和前列腺癌患者术后1周后，禁饮食12 h后收集中后段尿液100 ml，放置低温冰箱中保存，并在2 h内予以离心，离心速度3 000 r/min，时间30 min，并分装在RNA酶处理过的Eppendorf管中，保存于-80℃的冰箱。

1.3.2 实时定量PCR：取尿液上清液用紫外光光度计分别检测在230 nm、260 nm和280 nm处的吸收值。实验采用Primer Premier 5.0 软件涉及引物。miR-128a引物序列，正向5’-ACACTCCAGCTGGGTCACAG

TGAACCG-3’，反向5’- CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-28-3p的引物序列，正向5’-CACCTAGCTTATCAG

ACTGATGTTGATTTTTTG-3’，反向5’-AGCTCAAAAA

ATCAACATCAGTCTGATTTTTTG-3’；U6引物序列，正向5’-ATTGGAACGATACAGAAGATT-3’，反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。使用20 μl的cDNA 的合成反应体系，使用PCR扩增仪，分别在26℃，42℃和85℃的温度下，分别反应30 min，30 min和10 min。最后将引物，定量PCR Master Mix， Taq DNA 聚合酶和cDNA 模板加入ddH2O中形成20 μl的反应体系。反应过程：分别在95℃，95℃和60℃，分别反应时间3 min，12 s和40 s，总共40个循环。以U6为内参，测定CT值。采用2-ΔΔCT表示miR-128a和miR-28-3p相对表达量，其中ΔΔCt=前列腺癌组(CT目的基因-CTU6)-健康对照组(CT目的基因-CTU6)。每个样本重复3次。

1.4 观察指标 观察3组尿液中miR-128a和miR-28-3p表达水平，比较术前术后前列腺癌表达水平的变化，与临床病理因素和预后的关系及其在诊断和判断预后的诊断效能。

2 结果

2.1 3组尿液miR-128a和miR-28-3p表达水平比较 前列腺癌组尿液miR-128a表达水平明显高于前列腺良性增生组和健康对照组(P<0.01)，且前列腺良性增生组表达水平明显高于健康对照组(P<0.01)，术后前列腺癌组尿miR-128a表达较术前明显降低(P<0.01)；而前列腺癌组尿液miR-28-3p表达明显低于前列腺良性增生组合健康对照组(P<0.01)，且良性前列腺增生组明显低于健康对照组(P<0.01)，术后前列腺癌组的miR-28-3p表达水平较术前出现明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 3组尿液miR-128a和miR-28-3p表达水平比较

2.2 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在诊断前列腺癌的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在诊断前列腺癌具有较高的灵敏度和特异性，将miR-128a和miR-28-3p进行Logistics分析，得方程=1.250XmiR-128a-2.351XmiR-28-3p+1.009，发现联合检测的灵敏度为76.9%，特异性为90.7%，其AUC为0.915明显优于单个指标miR-128a(Z=3.859，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.861，P<0.01)，而miR-128a与miR-28-3p比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图1。

表2 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平诊断前列腺癌的效能

图1 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在诊断前列腺癌曲线下面积比较

2.3 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平与前列腺癌临床病理因素的关系 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平与Gleason评分、肿瘤直径、分化类型和肿瘤分期呈明显相关性(P<0.05或<0.01)，而对年龄和PSA水平无明显相关性(P>0.05)。见表3。

表3 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平与前列腺癌临床病理因素的关系

2.4 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平与前列腺癌预后的关系 患者随访2年，41例患者死亡为死亡组，76例存活为存活组。死亡组的尿miR-128a表达水平明显高于存活组(P<0.01)，而尿miR-28-3p表达水平死亡组低于存活组(P<0.01)。见表4。

表4 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平与前列腺癌预后的关系

2.5 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在预测2年内死亡的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在预测2年内死亡具有较高的灵敏度和特异性，通过Logistics分析综合两指标得方程=1.091XmiR-128a-3.297XmiR-28-3p-0.876，联合检测的灵敏度为82.9%，特异性为82.9%，其AUC为0.895明显优于单个指标miR-128a(Z=2.621，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.168，P<0.05)，而miR-128a与miR-28-3p比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5，图2。

表5 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平在预测2年内死亡的效能

图2 尿miR-128a和miR-28-3p表达水平预测2年内死亡的效能

3 讨论

诊断前列腺癌的金标准是组织活检，但患者往往出现症状活检时已经属于晚期，并且属于一种侵入性检测手段。目前较为广泛使用的PSA作为前列腺癌筛查和预后的重要指标，但其特异性和灵敏度仍不尽人意。有文献表明miRNA通过外泌体进行细胞信息的传递，外泌体是一种囊泡样结构，存在血液、尿液、精液和唾液等体液中，具有调节细胞的生物学行为[7]。研究表明尿液外泌体中的miRNA可以反映细胞的代谢情况，并且发现尿液中的外泌体具有miRNAs含量高，且比血液等更为稳定，能够反映泌尿生殖系统的病变[8]。故尿液中外泌体的miRNA是最有潜力成为诊断前列腺癌和预后判定的重要无创分子标记物[9]，为前列腺癌的诊断和预后判定开辟了一条新的路径。

本研究发现前列腺癌组尿液表达miR-128a水平明显高于良性前列腺增生组和健康对照组，且手术后其表达水平明显下降，说明miR-128a参与了前列腺癌的发生发展，与前列腺癌具有明显相关性。本研究还发现与Gleason评分、肿瘤直径、分化类型和肿瘤分期具有明显的相关性，说明尿液中miR-128a表达水平高低与前列腺癌的恶性程度具有明显相关性，与前列腺癌分期相关。本研究通过随访2年，发现与死亡组比较前列腺癌患者生存患者尿液中的miR-128a表达水平出现明显降低，说明尿液miR-128a表达水平是前列腺癌预后的重要指标。现已知miR-128a在乳腺癌和神经系统的肿瘤中出现明显下降[10]，表现为抑癌基因，而在我们研究中发现其表达出现明显升高，说明在前列腺癌患者中miR-128a为促癌基因，对前列腺癌的发生发展具有促进作用。与郭学军等[11]研究发现miR-128a在肝癌组织中呈高表达，并且认为miR-128a能够促进肝癌细胞的增殖类似。本研究开发现尿液miR-128a表达在诊断前列腺癌患者的灵敏度为61.5%，特异性93.3%，AUC为0.815，说明尿液外泌体中的miR-128a在诊断前列腺癌具有一定的临床诊断价值。本研究还发现在预测2年内死亡方面具有较高的诊断效能，故对预测2年内死亡具有较高的诊断效能，说明尿液miR-128a表达为预测预后较好的指标。

本研究发现前列腺癌患者尿液中miR-28-3p表达水平明显低于良性前列腺患者和健康体检者，且手术后尿液中miR-28-3p表达出现明显升高，说明miR-28-3p在前列腺癌中是重要的保护基因，作为抑癌基因的角色，对前列腺癌的发生发展具有重要作用。有研究表明miR-28-3p在食管鳞状细胞癌[12]出现明显高表达，而在结肠癌的研究中发现出现明显低表达[13]，说明miR-28-3p在不同肿瘤中有着不同的作用。与文献表达血清miR-28-3p表达与非小细胞肺癌患者的预后相关[14]一致。本研究还发现尿液中miR-28-3p表达水平与诊断前列腺癌和判断预后具有较高的效能，AUC为0.915明显高于单独miR-128a和miR-28-3p指标的检测，说明两者指标在检测前列腺癌具有一定的互补作用。本研究还发现联合检测尿液中miR-128a和miR-28-3p水平在预后2年内死亡的灵敏度和特异性均高达82.9%，曲线下面积为0.895，均高于单纯指标的检测，说明两指标在预测预后方面具有某种联系，类似癌基因和抑癌基因这两种基因，内在存在一定的联系，故对于尿液miR-128a表达>3.753和miR-28-3p表达≤1.2患者是否需要采取进一步的干预，这些干预是否能够改变预后及其可能的机制还需要进一步研究。

综上所述，MiR-128a和miR-28-3p参与了前列腺癌的发生发展，在诊断前列腺癌和判断预后具有重要临床价值。