bFGF联合胶原膜对硬腭软组织缺损大鼠病理及创面愈合的影响

马 超，焦建军

临床上对口腔软组织进行修复时多采用自体游离皮瓣、肌皮瓣、黏膜瓣等，选用皮瓣、膜瓣能显著提高移植物的存活率，但口腔环境较为特殊，移植组织无法与缺损区域完全结合时可能造成组织畸形，如移植后组织瓣出现毛发、汗腺等结构，可能需进行二次移植手术，多次手术给患者带来巨大痛苦、延误病情[1-3]。随着组织修复研究的深入，胶原膜作为一种生物相容性、降解能力较好的组织修复材料，目前已在临床上得到了较为广泛的应用，在口腔黏膜损伤、牙龈缺损、萎缩等领域中取得了较好的效果[4-5]。组织再生、修复过程中血管新生是极其重要的一个环节，碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)能对其起到促进作用[6]。有研究证实，bFGF对创伤愈合、骨组织生长、韧带愈合均有一定的促进作用，在骨肌腱愈合上同样疗效显著，但有关bFGF结合胶原膜对硬腭软组织缺损修复的相关报道仍较为罕见[7]。基于此，本文通过对大鼠进行建模分组实验，探讨bFGF联合胶原膜对大鼠硬腭软组织缺损病理及创面愈合的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 30只SPF级健康Wistar大鼠，6周龄，平均体质量(200.94±10.22)g，购自长沙天勤生物，动物质量合格证号：SCXK(湘)2019-0006。

1.2 主要试剂和仪器 bFGF与胶原膜(烟台正海生物)，结合bFGF/胶原膜(中国科学院遗传与发育生物学研究所)、Trizol试剂(上海联硕生物科技有限公司)，逆转录试剂盒(武汉赛维尔生物技术有限公司)，RT-PCR试剂盒(上海优予生物科技有限公司)，油酸(上海士锋生物科技有限公司)，ECL电化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，光学显微镜(奥林巴斯，日本)，荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，凝胶电泳系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 模型制备 建模方法参考刘双喜等[8]的研究，对30只大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，撑开大鼠口腔后，于口腔内硬腭第一磨牙中心处至第三磨牙远中软组织中央，采用切龈刀切3 mm直径的圆形缺损，再以探针将缺损边缘膜瓣去除，实验中切勿造成骨面损伤，处理完后以无菌棉球压迫止血，整个实验于无菌条件下操作。

1.4 分组处理 将30只模型大鼠随机分为3组：Bf组、Dd组、Nc组，每组各10只，Bf组大鼠采用结合bFGF/胶原膜植入，Dd组仅采用胶原膜植入，大小(5 mm×7 mm)基底膜向外粗糙面，面向骨面，边缘处利用探针进行贴合处理，将胶原膜与黏骨模板做缝合处理，Nc组不进行植入修复处理。术后3组大鼠均连续给予5万单位青霉素肌注，并在饮水中添加甲硝唑预防感染，术后一周内给予软质饮食，同时给予营养液。

1.5 HE染色 术后2周断头处死大鼠，取其整个上颌骨，切取硬腭部分，采用4%甲醛溶液固定36 h，EDTA脱钙处理后再用乙醇溶液脱水，以每个标本矢状面中央切开，从中央到两边行5 μm连续矢状面切片，苏木精和伊红染色液分别复染6～8 min，在10×40倍显微镜下观察硬腭组织形态改变情况，将剩余硬腭组织保存于-80 ℃，以便后续实验中提取蛋白。

1.6 创面愈合率 在10×40的高倍光学显微镜下观察HE染色切片，采用Image Pro Express 6.0图像处理软件测量创面两端上皮组织间的距离，计算每张切片创面愈合率，百分比越高创面愈合率越好，根据创面愈合率=(3-上皮组织间距离)/3×100%公式进行计算。

1.7 微血管计数 在10×40的高倍光学显微镜下观察HE染色切片，随机选取3个视野计算新生血管的数目，血管形态完整、管腔中含有红细胞、管壁有内皮细胞的即为新生血管，将所选择视野的新生血管数取平均值。

1.8 RT-PCR检测硬腭组织胶原 mRNA表达量将大鼠硬腭组织剪碎，加入胰蛋白酶消化，PBS溶液冲洗，滴入0.9%Nacl溶液，Trizol法提取总RNA，取1 μg RNA反转录成cDNA，再进行荧光定量PCR实验检测Ⅰ型胶原(TypeⅠ Collagen,ColⅠ)、ColⅢ mRNA表达水平，按说明书步骤操作。内参采用β-action，实验条件为：60 ℃、10 min；95 ℃、72 ℃，各30 s ；95℃，5 min；循环40次，ColⅠ基因正向引物5′-GAGCTGGTGTAATGGGTCCT-3′，反向引物5′-GAGACCCAGGAAGACCTCTG-3′；ColⅢ基因正向引物5′-CTCAGCACTAGAATCTGTCC-3′，反向引物5′-TGGTGTTGGAGCCGCTGCCA-3′；β-actin正向引物5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′，反向引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′。以2-ΔΔCT法计算ColⅠ、ColⅢ相对表达量。

1.9 Westernblot法检测硬腭组织胶原蛋白表达 将大鼠硬腭组织剪碎，加入胰蛋白酶消化，PBS冲洗，提取细胞内总蛋白，测定蛋白浓度，进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转、封闭、添加一抗过夜、酶标二抗孵育、电化学发光显色，采用凝胶成像系统拍照，软件自动计算灰度值作为蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 HE染色观察 3组大鼠硬腭组织均有较多的炎症细胞浸润。Bf组可发现成纤维细胞生成增多，明显新生血管生成，仅见少量胶原膜；Dd组新生血管数量及成纤维细胞较Bf组少；Nc组新生血管数量及成纤维细胞少于其他两组，图1。

图1 HE染色(×200)

2.2 创面愈合率 与Nc组、Dd组比较，Bf组愈合率有所升高，3组比较差异均有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 3组创面愈合率的比较*#分别表示与Bf组、Db组比较，P<0.05

2.3 微血管计数比较 与Nc组比较，Bf组新生血管数量增加，与Dd组比较，Bf组新生血管数量亦有所增多，3组新生血管数量差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 3组新生血管数目的比较*#分别表示与Bf组、Db组比较，P<0.05

2.4ColⅠ、ColⅢmRNA表达情况的比较 与Bf组比较，Dd组大鼠ColⅠ、ColⅢmRNA水平显著升高，与Dd组比较，Nc组大鼠ColⅠ、ColⅢmRNA水平显著升高，3组ColⅠ、ColⅢmRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05，图4)。

图4 3组ColⅠ、ColⅢ mRNA表达情况*#分别表示与Bf组、Db组比较，P<0.05

2.5 硬腭组织ColⅠ、ColⅢ蛋白表达的比较 与Bf组比较，Dd组大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表达增加明显，与Dd组比对，Nc组大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表达有所增加，Nc组ColⅠ、ColⅢ蛋白表达最高，Dd组其次，Bf组最低，3组差异有统计学意义(P<0.05，图5)。

图5 硬腭组织ColⅠ、ColⅢ蛋白表达*#分别表示与Bf组、Db组比较，P<0.05

3 讨论

口腔软组织缺损诱发因素较多，如先天畸形、外伤、肿瘤切除等，修复后组织易出现僵硬、瘫痕等，严重者甚至会丧失口腔功能，出现语言障碍、张口困难，还可能造成上颌发育异常，因此软组织缺损修复与重建仍是临床口腔外科工作者的研究重心之一[9]。近年来，胶原膜以其较好的生物相容性和可降解特性从多种修复材料中脱颖而出，它不仅能促进凝血，还可以增加细胞附着能力，适用范围愈发宽广[10]。研究发现胶原膜能结合多种生长因子，使这些因子缓慢释放于缺损部位，进而发挥更强的促修复效能，成为近年来临床研究热点之一。bFGF是成纤维生长因子家族成员之一，临床实验中发现bFGF能促进细胞增殖与分裂，介导新生血管生成，并且参与了人体多种组织的修复过程[11]。本研究主要探讨了胶原膜与bFGF的结合用于口腔硬腭软组织缺损的修复效果及其可能的分子机制，以期为临床口腔软组织缺损修复提供参考。

本研究通过大鼠建模与分组修复实验发现，Bf组大鼠硬腭组织缺损处可发现成纤维细胞生成增多，明显新生血管生成，胶原膜也发生一定吸收，Dd组新生血管数量及成纤维细胞较Bf组少，而未接受任何植入修复的Nc组新生血管数量及成纤维细胞最少。定量比较发现Bf组创面愈合率及微血管数最高，Dd组其次，Nc组创面愈合率最低。在软组织缺损修复时，血管新生是十分重要的一个过程，新生的血管可以为创伤组织输送血液、氧及营养物质，还会将组织代谢产物运出损伤区域，促进细胞的增殖分化，进而促进了损伤区域的修复[12-13]。胶原膜为异种脱细胞真皮基质，其成分主要为细胞外基质与胶原，可连接血管内皮细胞与成纤维细胞，为其提供优良的生存环境，使得细胞能在其支架上生长、增殖，并分泌新的细胞外基质，从而完成对缺损部位的修复与重建[14-15]。bFGF属于促细胞生长因子，在诱导毛细血管生成、刺激组织细胞生长中具有重要作用，机体损伤后可自发分泌bFGF，但分泌量较少，而采用胶原膜结合bFGF，能使其在缺损部位达到有效浓度，同时在较长一段时间能维持缓慢释放，bFGF对上皮细胞增殖有明显效用，使得损伤边缘向中心生长修复，创面明显缩小，伤口愈合率能明显升高[16-17]。既往刘双喜等[8]采用bFGF/胶原膜复合材料亦达到了提高创面愈合率与新生血管数的效果，与本研究一致。

此外，本研究通过对3组大鼠相关分子表达进行测定发现，Nc组ColⅠ、ColⅢ mRNA及蛋白质表达水平最高，Dd组其次，Bf组最低。ColⅠ、ColⅢ是细胞外基质的主要成分，反映了胶原代谢状况，文献报道创伤后瘢痕形成与ColⅠ、ColⅢ在体内过渡沉积有关，损伤修复停止后，胶原蛋白合成就会增加，促使局部生长因子过度分泌，引发炎性细胞浸润，刺激局部细胞增生、肥大，促进细胞外基质合成，阻碍组织修复进程[18-20]。有研究者发现，bFGF结合胶原膜修复软组织损伤促进血管新生，为损伤区域提供充分的血供，将创伤愈合期间产生的胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等代谢物运出损伤区，加快组织修复，明显提高创面愈合速度，这与本研究结果中Bf组ColⅠ、ColⅢ表达下调一致[21]。

综上所述，bFGF联合胶原膜能进一步促进硬腭软组织缺损的修复，提高创面愈合率，该作用可能与下调ColⅠ、ColⅢ表达有关。未来可以从胶原蛋白表达的信号通路继续进行实验研究，以进一步明确bFGF对胶原蛋白的调控机制如何影响组织修复重建过程。