弥漫大B细胞淋巴瘤患者miR-125表达水平与临床病理及预后的关系分析

兰 坚，杨蜀锦，李 妮，王 娇

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL)属B细胞非霍金奇淋巴瘤(Non-Hodhkin′s Lymphoma，NHL)常见类型，侵袭性强，进展快，其临床表现、形态学、免疫表型及遗传特点均存在异质性，疗效评估及预后判断难度大，不利于指导临床决策[1-2]。目前亟待寻找有效生物标志物指导预后分层。即往多采用国际预后指数(International Prognostic Index，IPI)评估DLBCL患者预后，包含年龄、一般状态评分、分期、结外受累、血清乳酸脱氢酶等参数，但近期报道显示，即便存在相同IPI患者仍可能出现不同预后，提示仅依靠临床特点评估DLBCL患者预后存在局限性[3]。最新研究认为，基因表达谱与DLBCL细胞起源密切相关[4]。微小RNA(Micro-RNA，miRNA)系一类非编码单链小分子RNA，参与靶基因调控，在细胞分化、增殖及凋亡等过程中均发挥重要作用[5]。miR-125位于染色体19q13，近年来发现其在恶性血液疾病中表达异常上调[6]，但与DLBCL患者发病、病理特征及预后的关系尚未完全明确。为探讨DLBCL患者miR-125表达特征、病理特征及预后的关系，并为DLBCL防治提供依据，现对收治的148例DLBCL患者的临床资料进行回顾性分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性采集2015年3月-2017年3月于四川大学华西医院血液内科收治的148例DLBCL患者的临床资料，作为DLBCL组。纳入标准：年龄≥18岁；符合中华医学会血液学分会,中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南(2013年版)》中DLBCL诊断标准[7]，经活检组织病理及免疫组化(包括生发中心来源与非生发中心来源DLBCL；免疫母细胞性、中心母细胞性、变异性形态学)确诊，病理见侵袭性大B淋巴细胞肿瘤，弥漫性生长，癌细胞核与正常组织细胞核接近或增大，细胞体积较正常淋巴细胞小(不超过2倍)；肿瘤直径>0.5 cm；采集标本前未接受放化疗或其他治疗；初发；临床及随访资料完善。排除标准：血管内及纵膈大B细胞淋巴瘤；累及中枢神经系统者；严重心肝肾肺功能不全；合并其他恶性肿瘤；其他惰性淋巴瘤转化为DLBCL者；合并人类免疫缺陷病毒感染；临床及随访资料不全者。其中男85例，女63例；年龄20～78岁，平均(56.41±10.35)岁；Ann Arbor临床分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期94例；IPI评分[9]：0～2分94例，3～5分54例。选择同期收治淋巴结反应性增生(Reactive Hyperplasia of Lymph Node，RH)患者35例作为对照组。其中男20例，女15例；年龄20～76岁，平均(55.97±9.86)岁。

1.2 方法

1.2.1 miR-125表达水平检测 入院后采集DLBCL及RH病理组织标本，连续10 μm厚度切片，二甲苯固定，14 000 r/min离心120 s后，弃二甲苯，无水乙醇震荡混合均匀，离心后弃上清，加入无水乙醇，震荡均匀，离心，室温晾干，参照RNA抽提试剂盒提取总RNA(试剂盒购自美国Sigma公司)，鉴定纯度及浓度满意后，进行逆转录反应(试剂盒购自美国ABI公司)，反应体系：dNTPs 0.15 μL+Reverse Transcroptase 1.0 μL+10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL+RNase Inhibitor 0.19 μL+Nuclese-free water补足至7.0 μL，取逆转录产物进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)(试剂盒购自美国Applied公司)，反应体系：20×TaqMan®Small RNA Assay 1.0 μL+RT reaction 1.33 μL+TaqMan®Universal PCR Master MixⅡ 10.0 μL+Nuclese-free water补足至20.0 μL，上美国ABI公司7500型荧光定量PCR反应仪器进行反应，反应条件：50 ℃、 120 s，95 ℃、 10 min，95 ℃、 15 s，60 ℃、 60 s，共40个循环，以U6为内参，U6引物、miR-125引物设计及合成均由美国Gene Copoeia公司进行，参照2-△△Ct公式计算miR-125相对表达量。

1.2.2 临床资料收集 调取所有DLBCL患者临床资料，包括性别、年龄、免疫表型、原发部位、Ann Arbor临床分期、实验室指标(血清乳酸脱氢酶水平)、IPI评分、体能状态评分[10]、B症状、结外累及情况、Ki-67指数等，分析miR-125与DLBCL患者临床病理特点的关系。

1.3 随访 所有患者均完成3年随访调查，采用电话随访、门诊复查等方式，自首次明确病理诊断开始随访，统计所有患者总生存期(Overall Survival，OS)(自确诊至DLBCL所致死亡或随访终止时间)。

2 结果

2.1 DLBCL组与对照组患者组织miR-125表达水平比较 DLBCL组患者组织miR-125表达水平明显高于对照组(t=16.886，P<0.05，图1)。

图1 DLBCL组与对照组患者组织miR-125表达水平

2.2 DLBCL组患者组织miR-125表达水平与临床病理参数的关系 DLBCL组患者组织miR-125表达水平与性别、年龄、原发部位、体能状况评分、B症状无明显关联(P>0.05)，免疫表型为非生发中心来源、Ann Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、乳酸脱氢酶>245 U/L、IPI评分3～5分、结外累及≥2处、Ki-67指数≥75%的DLBCL患者miR-125表达水平更高(P<0.05,表1)。

表1 DLBCL组患者组织miR-125表达水平与临床病理参数的关系

2.3 DLBCL组患者miR-125表达水平影响因素分析 纳入单因素分析中有统计学意义数据进入多因素回归方程进行赋值，结果显示，免疫表型、乳酸脱氢酶水平、IPI评分与Ki-67指数均为miR-125表达相关影响因素(P<0.05)，免疫表型为非生发中心来源、乳酸脱氢酶水平越高、IPI评分越高、Ki-67指数越高，组织miR-125表达越高，表2。

表2 DLBCL组患者miR-125表达水平影响因素分析

2.4 DLBCL组患者miR-125表达对预后的影响 按miR-125表达水平高低分为低miR-125表达组(miR-125<4.00，n=78)与高miR-125表达组(miR-125≥4.00，n=70)，低miR-125表达组出现随访期间死亡2例，总生存率为97.4%，中位生存时间为36.30个月；高miR-125表达组随访期间死亡16例，总生存率为77.1%，中位生存时间为33.67个月，两组生存情况比较(LogRankχ2=4.488，P=0.034<0.05)，差异有统计学意义(图2)。

图2 不同miR-125表达DLBCL患者生存曲线比较

3 讨论

DLBCL高度异质性血液系统恶性肿瘤，大多侵袭性较强[11]。以往多通过肿瘤形态学进行分类，但与患者病情进展、预后无明显关联[12-13]。目前，多依据肿瘤细胞基因表达谱及免疫组化特征将其分为生发中心来源与非生发中心来源，一般后者预后更差[14]。但最新报道发现，仍有较大一部分生发中心来源DLBCL患者病情缓解后可能复发或对治疗无明显反应性，预后不理想[15]。以往IPI评分常被用于预测DLBCL预后，但刘宜平等[16]发现，相同IPI评分患者仍存在不同预后，该观点认为，IPI评分尚无法完全反映DLBCL患者异质性特征。

miR-125是近年来发现与血液系统恶性肿瘤发病及进展高度相关的小分子RNA。研究发现，miR-125在多种血液系统肿瘤均可见异常表达，且其作用存在差异[17-18]。Baraniskin等[19]研究显示，在慢性淋巴细胞白血病及多发性骨髓瘤患者中miR-125存在典型抑癌作用。而在急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病中存在典型癌基因作用[20]。但对DLBCL发病过程中miR-125的作用尚未完全明确。张文婷等[21]发现，miR-125在DLBCL复发或进展时表达异常改变，高miR-125表达水平通常提示更短的生存时间。本研究留取DLBCL患者组织标本，并与RH对照，发现DLBCL患者组织miR-125表达较RH明显上升，支撑阙喜妹等[22]研究结论，提示miR-125在DLBCL发病过程中存在癌基因作用，参与DLBCL发病过程。同时本研究还发现，免疫表型、IPI评分、Ki-67指数均影响DLBCL患者miR-125表达，提示miR-125对区分DLBCL免疫表型，评估预后存在价值。分析原因可能为：miR-125上调可能促进核转录因子κ-轻链增强，活化下游靶基因，促进DLBCL发生及进展，在DLBCL发病中存在诱导及触发作用[23]。同时miR-125参与细胞分化、增殖及代谢等构成，调控靶基因转录水平，影响肿瘤生物学行为，推测高miR-125表达通过促进DLBCL细胞恶性表型转化，导致DLBCL进展，并影响其预后。王韦婷等[24]认为血清乳酸脱氢酶影响NHL患者预后，高乳酸脱氢酶患者预后更差。本研究发现在DLBCL患者中存在相似结果，且DLBCL患者乳酸脱氢酶表达对miR-125水平存在影响，推测两者均参与DCBCL发病过程，对预后有一定影响，但尚需进一步展开分子机制研究证实。而miR-125与DLBCL结外累及范围、临床分期等无关，支撑曹迪等[25]结论，考虑临床分期主要依据病变累及部位及范围划分，而miR-125与DLBCL病变受累范围及部位无明显关联。

也有研究发现，miR-125高表达血液系统恶性肿瘤患者OS更短[26]。本研究所有患者均完成3年随访调查，随访截止日miR-125低表达患者中位OS为36.30个月，而高表达miR-125中位OS为33.67个月，miR-125高表达患者随访结束总生存率低于低表达患者，这与Nakayama等[27]统计的5年生存率明显差异存在相似结论，进一步证实高miR-125表达的DLBCL患者生存预后更差。

综上，本研究认为，DLBCL患者组织miR-125呈明显高表达，与患者免疫表型、乳酸脱氢酶水平、IPI评分、Ki-67指数有关，对患者预后存在一定的影响，高表达miR-125提示更短的生存期。推测高表达miR-125可能通过影响免疫表型、乳酸脱氢酶水平及Ki-67指数等参与DLBCL发病及进展过程，但对其确切机制尚待进一步研究论证。