复方蛹虫草粉抗肿瘤活性的研究

甄亚欣 李爱民 赵明明 冯康 李子杰

摘要：本研究采用复方蛹虫草粉水提取物，研究其对肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和慢性髓原白血病细胞K562的抑制作用。复方蛹虫草粉水提取物对受试细胞处理24、48h后，采用CCK-8显色法测定对肿瘤细胞的抑制率，并通过荧光显微镜观察细胞的形态变化。结果表明，复方蛹虫草粉水提取物对A549、MCF-7和K562细胞均有较强的抑制效果，处理48 h时效果最好，对A549、MCF-7、K562的抑制率分别达到了48.6%、13.4%和80.5%。細胞形态上表现为细胞膜均遭到破坏，内容物泄露。

关键词：复方蛹虫草粉；抗肿瘤；细胞增殖

引言

蛹虫草又称北冬虫夏草，国家卫生健康委已经将蛹虫草加入药食两用的中药名单，具有很高的药用价值。蛹虫草中生物活性物质主要有虫草素、虫草多糖、虫草多肽等，具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等生理活性，已经逐渐应用到保健、医药等领域。虫草多糖能够诱导T-淋巴细胞增殖，增强IL-2、IL-6的分泌，同时还可以增强巨噬细胞的吞噬作用。另有研究证实，虫草素能够抑制肺癌细胞A549和肺癌细胞H358的生长，且抑制作用呈剂量依赖性。

目前已有一些虫草制品、富硒制品被证实具有抗肿瘤的功效，但其疗效尚有待进一步提高。为了更好地开发利用蛹虫草、松花粉、硒、裸藻等天然资源，本研究选用按照特定比例进行复配的复方蛹虫草粉，将其水提取物分别作用于人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7和人慢性髓原白血病细胞K562，研究其对如上三种肿瘤细胞生长的影响，并对其细胞形态进行观察，为复方蛹虫草粉类产品的资源开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7和人慢性髓原白血病细胞K562均购自南京科佰生物科技有限公司。复方蛹虫草粉由国珍健康科技（北京）有限公司提供。DMEM无血清细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、100×青链霉素混合液均购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自Roche公司；DMSO购自Solarbio公司；CCK-8购自Donjindo公司；PBS（磷酸盐缓冲液）购自BBI life science公司；二氧化碳培养箱购自Panasonic公司；倒置光学显微镜、荧光显微镜均购自日本尼康公司；台式冷冻离心机购自HITACHI公司；Stat Fax-2100型酶联免疫检测仪购自BIO-RAD公司；T25细胞培养瓶购自Fisher公司；HH-4型数显恒温水浴锅购自Thermo公司；YDS-20型液氮生物容器购自成都金凤液氮容器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2D型）购自NUAIRE公司。

1.2复方蛹虫草粉水提取物的制备

称取复方蛹虫草粉0.5g，用50mL 60℃热水浸提1.5h，重复两次，合并提取液，0.45μm滤膜过滤，低温浓缩至无水状态，加入1mL去离子水复溶，真空干燥，称重，配制提取物浓度为2mg/mL的溶液，再用0.22μm滤膜过滤。取1mL提取物，加入9mL培养液，得终浓度为200μg/mL。

1.3肿瘤细胞抑制实验测定

选取对数生长期的A549、MCF-7和K562细胞，以1×105个/mL接种于96孔板中，每孔100μL。待细胞培养12h后，加入复方蛹虫草粉水提取物，每孔100μL，每个样品设置6个平行，对照组加入等体积含胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱中孵育24h、48h。培养结束后，小心吸出原培养液，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1-4h后使用酶标仪测定450 nm波长下的吸光值。按如下公式计算提取物对细胞的抑制率：

抑制率（%）=（实验组OD值-阴性组OD值）/（阴性组OD值-空白组OD值）×100%

1.4肿瘤细胞形态观察

选取对数生长期的A549、MCF-7和K562细胞，以1×105个/mL接种于12孔板中，每孔1mL。待细胞培养12h后，加入复方蛹虫草粉水提取物，每孔1mL，对照组加入等体积的培养液，置于37℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱中孵育48h。培养结束后，小心吸出原培养液，用PBS轻轻的冲洗细胞2次后，加入一定体积的台盼蓝染色后荧光显微镜观察。对于K562悬浮细胞，直接吸取一定体积的培养液，1000rpm，离心5分钟，用PBS冲洗一次，离心后加入一定体积的培养基轻轻吹打混匀，加入等体积的台盼蓝进行染色，荧光显微镜观察。

1.5数据分析

数据采用Spss 24.0进行统计分析。

2. 结果

2.1复方蛹虫草粉水提取物对人肺癌细胞A549生长的影响

复方蛹虫草粉水提取物处理A549细胞24、48h后，表现出一定的抑制效果。处理24h后，与对照组相比，复方蛹虫草粉水提取物显著抑制了A549细胞的增殖（P<0.01），抑制率达到22.3%。处理48h后，与对照组相比，复方蛹虫草粉水提取物显著抑制了A549细胞的增殖（P<0.01），抑制率达到了48.6%。

2.2复方蛹虫草粉水提取物对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

复方蛹虫草粉水提取物处理MCF-7细胞24、48h后，表现出了一定的抑制效果。处理24h后，与对照组相比，复方蛹虫草粉水提取物对MCF-7细胞的增殖无显著影响（P>0.05）。处理48h后，与对照组相比，复方蛹虫草粉水提取物显著抑制了MCF-7细胞的增殖（P<0.01），抑制率达到13.4%。

2.3 复方蛹虫草粉水提取物对慢性髓原白血病细胞K562生长的影响

复方蛹虫草粉水提取物作用K562细胞24、48h后，表现出较强的抑制作用。处理24h后，复方蛹虫草粉水提取物显著抑制了K562细胞的增值（P<0.01），抑制率为66.0%。处理48 h后，复方蛹虫草粉水提取物显著抑制了K562细胞的增值（P<0.01），抑制率为80.5%。随着处理时间的延长，抑制率不断增加。

2.4复方蛹虫草粉水提取物处理不同细胞后的形态观察

复方蛹虫草粉水提取物对A549细胞处理48h，染色后采用荧光显微镜进行观察。对照组细胞完好无损，实验組细胞间的间隔模糊不清，出现一些红色的碎片即为细胞破碎后的残体。

复方蛹虫草粉水提取物对MCF-7细胞处理48h，染色后采用荧光显微镜进行观察。对照组细胞大多数完好无损，实验组细胞膜破裂，内容物流出。

复方蛹虫草粉水提取物对K562细胞处理48h，染色后采用荧光显微镜进行观察。对照组细胞结构完整无损，实验组细胞膜破裂，且无法辨别出细胞膜的形态。

3 讨论

从体外细胞实验结果来看，在一定的浓度下，复方蛹虫草粉水提取物对A549、MCF-7和K562细胞均有一定的抑制作用，最佳抑制率分别为48.6%、13.4%和80.5%。当作用时间为48h时，K562细胞对于复方蛹虫草粉水提取物更加敏感。从荧光显微镜结果来看，复方蛹虫草粉水提取物对A549的细胞膜损害作用较大，不仅能够损害细胞膜，还能促进细胞膜裂解。复方蛹虫草粉水提取物对MCF-7的细胞膜具有一定的损害作用，但是毒作用较低，只是造成细胞膜破裂，内容物流出。复方蛹虫草粉水提取物对K562的细胞膜损害作用非常大，细胞膜几乎完全裂解，促进了细胞的凋亡。细胞形态的结果与抑制率结果相一致。

通过比较复方蛹虫草粉水提取物对A549、MCF-7和K562细胞的抑制情况，我们发现，虽然复方蛹虫草粉水提取物能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，但对不同的肿瘤细胞其抑制效果并不相同，这表明复方蛹虫草粉水提取物对肿瘤细胞的增殖抑制作用具有特异性，可能对某些特定的肿瘤细胞具有较好的疗效。一方面可能是由于细胞形态结构不同所造成的；另一方面可能是三种癌细胞的细胞信号通路调控不同、干预不同阶段的细胞周期所致。

另外，研究证实硒化蛹虫草多糖的抗肿瘤活性与硒含量呈正相关，富硒蛹虫草诱导NCI-H292细胞凋亡呈浓度依赖性，蛹虫草多糖对HepG2肝癌细胞的抑制率与浓度和作用时长呈正相关。本研究中只选用了一种浓度处理细胞，因此，还需要进一步研究不同梯度的复方蛹虫草粉水提取物对肿瘤细胞的抑制作用是否存在浓度依赖性，为复方蛹虫草类产品的开发提供充分的理论依据。

作者简介：

甄亚欣（1995-），女，汉族，河北石家庄人，硕士，研究方向：食品加工。