黄芪多糖的分离纯化及结构鉴定研究进展*

2021-02-26 06:54张明宇王知斌
化学工程师 2021年12期
关键词:单糖脱色色素

张明宇,马 悦,王知斌

(黑龙江中医药大学 药学院 教育部北药基础与应用研究重点实验室 黑龙江省中药天然药物药效物质基础研究重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040)

药用黄芪始载于《神农本草经》,为豆科植物蒙 古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。于春、秋二季采挖,除去须根和根头,晒干而得。有排脓止汗、补气升阳,益卫固表,托毒生肌,利水退肿之功效。黄芪是一年生或多年生草本、亚灌木或灌木,豆科最大的开花植物属之一,广泛分布于温带和干旱地区[1]。黄芪是中国传统中药,药用历史已经有2000 多年。本文主要对黄芪多糖Astragalus Polysacharin(APS)类化合物的分离纯化及结构鉴定两个方面的内容进行了综合归纳,对APS 化合物的性质进行更充分的了解,为其临床应用提供基础依据。

1 黄芪多糖的分离纯化

1.1 黄芪多糖的提取

APS 提取的常用溶剂包括水、甲醇、乙醇等。方法主要为溶剂提取法,包括水提取法(水煎煮法、碱水提取法);醇提取法(醇水提取法、碱醇提取法)。其他方法包括微波提取法、超声波提取法、超高压提取法、超细粉碎提取法、纤维素酶法。各提取方法操作见表1。

表1 APS 的提取方法Tab.1 Extract method of APS

1.2 分离纯化

经过初步的提取得到的是含有杂质的粗APS提取液,欲得到纯净的APS,需要去除蛋白质、色素等多余杂质。

1.2.1 除蛋白质方法 去除蛋白质的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、鞣酸法和蛋白酶水解法等。前3 种方法的原理是加入有机溶剂使样品中的蛋白质变性成沉淀离心分离;鞣酸可与蛋白质发生特异性反应使其凝固沉淀;蛋白酶法除蛋白的原理是其使样品中蛋白质降解,再用透析或沉淀的方法除去蛋白质[2]。其中Sevage 法较为常用,条件为Sevage 试剂中氯仿∶正丁醇=4∶1,粗多糖溶液(2g·L-1)与Sevage 试剂的体积比为2∶1,搅拌时间为25min 时,Sevage 法去除蛋白质反应较为温和[3],采用3~4 次处理可达到较为理想的处理结果。若采用Sevage 法处理多糖蛋白6 次,蛋白质含量下降70.8%,多糖损失率为4.4%[4]。即蛋白质含量虽下降,但多糖损失率也随之升高。据文献报道,将酶解法和Sevage 法联用除蛋白效果较好。研究对比Savage 法、絮凝剂法、三氯乙酸法、蛋白酶-Savage 法4 种方法的蛋白质去除率及多糖损失率,结果表明,蛋白酶-Savage 法两项指标均优于其它方法[5]。

1.2.2 除色素方法 经初步提取的粗多糖常常含有色素,需要进行脱色处理,色素分为脂溶性和水溶性。常用的脱色方法有氧化法、吸附法、离子交换法和金属络合物法等[14]。DEAE-纤维素柱吸附法是目前最常用的脱色素方法,利用0.1mol·L-1的NaCl 溶液洗脱,DEAE-纤维素柱纯化可以得到APS 的主要级分[15];采用D101 大孔吸附树脂纯化100mL 浓度为1.8mg·mL-1的黄芪粗多糖溶液时,采用4 BV 的50%乙醇为洗脱剂,以1mL·min-1的流速进行洗脱为最佳条件,可获得纯度为65.1%的APS[16];采用AB-8 大孔吸附树脂纯化不同浓度乙醇洗脱样品,得到的APS 最高纯度可达96.1%[17];通过比较S-8、AB-8、X-5、NKA-9、D4020 和D3520 6 种树脂吸附APS 的吸附量及解吸率,结果表明,X-5 树脂固定床进行分离富集后,APS 的回收率较高,并且纯度得到了提高[18]。以可见光区光谱曲线下面积为测定指标对比粉末活性炭脱色、颗粒活性炭脱色、DEAE-52脱色、过氧化氢脱色4 种除去APS 色素的方法,发现DEAE-52 脱色素在不损失较多多糖的同时,有着相对较高的色素脱除率[19]。

2 黄芪多糖的结构鉴定

黄芪多糖结构测定方法可分为化学分析法和仪器分析法。

传统的化学分析方法 主要包括多糖分子量的测定、单糖组成分析、糖醛酸还原、完全酸水解、部分酸水解、甲基化分析、高碘酸氧化和Smith 降解法;

仪器分析法 主要包括旋光度测定法、紫外光谱(UV)、傅里叶红外光谱(FTIR)、核磁共振(NMR)、气相色谱(GC)和质谱(MS)等。

(1)鉴定中药各种化学成分的分子结构 旋光度法只能鉴定有旋光性的化合物,可根据产生的旋光性的不同区分化合物是否存在杂质。紫外光谱(UV)是由于电子的跃迁落于紫外可见光区而产生的,因此,可根据不同类型的化合物的紫外吸收强度判断化合物类型,当光子不足以使电子跃迁而落于不可见的红外光区时,就可能引发原子和基团共价键合的振动能级跃迁,使共价键发生不同类型的振动。因此,通过傅里叶红外光谱(FTIR)可观察化合物的结构和化学键的信息。核磁共振(NMR)对于中药化学成分结构的鉴定往往查看其对应的一维谱图和二维谱图,两者相互结合分析得出结构信息,熟练掌握后甚至可以从数据中直接推断原子的连通性和空间排列[20]。

(2)中药组分分离与定量分析或定性鉴定 采用气相色谱(GC)与质谱(MS)联用于进行分析与鉴定。样品制备步骤简单,样品用量少,避免了提取和蒸馏过程中溶剂中杂质的潜在干扰,尤其适用于中药中可挥发性成分。

(3)越来越多的研究着重于APS 结构分析的单糖组成和糖苷键连接状况。对膜荚黄芪内的低分子量多糖LMW-ASP 进行结构解析,经过高碘酸盐氧化和Smith 降解处理后通过GC 系统得出其分子量为5.6×103Da,由Glc、Gal、Ara、Xyl、GalA 组成,其摩尔比为10.0∶1.3∶1.7∶1.0∶0.9[21];蒙古黄芪内的多糖经FTIR 和GC 系统结构解析后发现,其单糖由Ara、Man、Glu、Gal 组成,摩尔比为0.0992∶1.26∶1.00∶0.0115[22];通过UV、FTIR、HPLC 等方法对膜荚黄芪内APS 进行结构解析发现其分子量为1.77×106、1.59×104Da 的APS 占比分别为38%和57%,单糖由Glc、Gal、Ara 组成,摩尔比为27.92∶5.20∶2.86[23];从蒙古黄芪中提取的一种黄芪多糖降解物纯化后经单糖组成分析、高碘酸盐氧化和Smith 降解、甲基化分析、ESI-MS、FTIR 和NMR 等方法技术发现由Rha以(3→)连接,Rha 以(1→3)连接,Araf 以(1→3,4)连接,Gal 以(1→3)连接,末端残基以-Gal 和-Glc 连接组成[24]。

各种APS 结构鉴定见表2。

表2 APS 的结构鉴定Tab.2 Structure identification of APS

3 结语

黄芪在中药使用上有“十药九芪”之称,被誉为“补气圣药”,因此,受到国内外学者的广泛关注,黄芪是一味药用历史悠久、医学应用极广的传统中药材,具有价格低廉、资源丰富、毒副作用小的优点,随着对其作用效果的深入研究而被应用于实际生产当中。例如将黄芪多糖用于家禽生产、疫苗研究、作为免疫兴奋剂、滋补剂、抗氧化剂、保肝剂、利尿剂、抗糖尿病、抗癌和祛痰剂等,充分利用其药理作用制成合适的剂型来治疗各种疾病,例如注射液被用来治疗心脏疾病、血液肿瘤疾病及泌尿系统疾病等,可见其广阔的发展前景。

APS 分离纯化和结构鉴定是生物活性方向研究的基础。在APS 的分离纯化中,考虑到实际分离纯化目的和经济条件,往往需要一种或几种分离纯化的方法相结合的方式进行。药材种类、提取溶剂、粉碎粒径、提取时间以及除杂方法均会影响提取效率,目前仍没有能够获得量大且纯净的APS 的方法。在APS 结构鉴定方面,不同的分离纯化技术会直接影响多糖的结构,采用不同的提取、分离方法得到的多糖,单糖组成、糖苷键连接状况、分子量大小可能均有所不同。多糖的结构复杂,能够明确多糖上述信息的方法已经较为成熟,但是明确其构效关系仍然是目前研究的难题。未来的分离纯化和结构鉴定应着重于APS 这两个方向研究,为黄芪多糖的深入临床药用奠定基础。

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