钾通道在HIV膜蛋白gp120致神经性疼痛中的作用及机制

郑凡艳，邓彩云，张 力，陈 芳，王文娟

(贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种破坏人体免疫系统的获得性免疫缺陷综合症。HIV感染后其外壳膜上的糖蛋白gp120可致中枢神经敏化，进而引起运动、感觉的失调，产生神经病理性疼痛等一系列严重的外周神经病变。近年来，HIV致神经性疼痛的发病率越来越高，HIV的病人可呈现不同程度的疼痛，这种顽固性疼痛目前亦无特效治疗药物[1]。此外，目前对于HIV相关的神经病理性疼痛的发病机制尚不明确，近年来发现离子通道在gp120直接兴奋初级传入神经元而导致痛觉过敏的过程中起着关键作用。其中，在疼痛发生、发展和传递过程中，电压门控性钾离子通道(Kv)发挥着重要的作用。本研究采用gp120作用于大鼠坐骨神经[2]，建立大鼠神经病理性疼痛模型，检测外向型钾离子通道Kv2.1、Kv4.2的蛋白表达情况，探讨钾通道在HIV致神经性疼痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康、清洁级SD雄性大鼠16只，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(黔)2012-0001。包膜糖蛋白gp120、兔多克隆抗体Kv2.1、兔多克隆抗体Kv4.2、山羊抗兔IgG-HRG购自abcam公司，兔β-Actin抗体、彩虹180广谱蛋白Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝公司，RIPA裂解液(强)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Western一抗、抗稀释液(碧云天生物技术公司)，HRP化学发光试剂盒、PVDF膜(美国Millipore公司)。

1.2 动物分组及大鼠gp120模型建立

1.2.1 动物分组 雄性SD大鼠均为健康、清洁级，体重为225～250 g，适应性喂养1周，随机数字表法将其分为gp120模型组和对照组，每组8只大鼠。大鼠的饲养条件为12 h明/暗循环，室温(21±1)℃，自由饮食和摄取水。

1.2.2 大鼠gp120模型建立戊巴比妥钠麻醉雄性SD大鼠，切开大鼠左腿侧弯凹陷皮肤，使坐骨神经暴露。实验组采用2 mm×6 mm氧化纤维素膜浸泡于250 μl浓度为0.1%大鼠血清白蛋白(RSA)生理盐水溶液中，其中含有100 mg gp120，对照组则放于不含gp120浓度为0.1%的大鼠血清白蛋白生理盐水中处理。大鼠血清白蛋白处理后的纤维素膜，缠绕与大鼠坐骨神经分叉部位且不要压迫神经。此外，若对照组大鼠术后存在任何的神经功能障碍，则剔除该实验中。

1.3 Western-blot 大鼠麻醉后，急性分离DRG神经元，匀浆裂解离心提取相关蛋白后，﹣20℃冰箱保存。10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，每孔上样20 g，转PVDF膜，BSA封闭2 h，一抗孵育过夜(4℃)，二抗孵育2 h(室温)。Bio-Rad ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统采集图像，采用Image Lab软件分析蛋白条带，以目的条带与各自内参β-action的灰度比值反映目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 Kv2.1蛋白表达 在大鼠术后14 d后，麻醉大鼠，急性分离DRG，提取相关蛋白。Western-blot结果显示，与对照组相比，gp120模型组Kv2.1蛋白浓度表达水平略降低，t=4，P>0.05。见图1。

2.2 Kv4.2蛋白表达 大鼠术后14 d，麻醉大鼠，分离DRG，提取相关蛋白。Western-blot结果显示，gp120模型组Kv4.2蛋白浓度表达水平明显低于对照组，t=69，P<0.05。见图1。

3 讨论

神经元超微结构的改变或者破坏是引起神经病理性疼痛的主要机制之一，HIV病毒通过其外壳表面膜上的糖蛋白gp120与免疫细胞上的CD4糖蛋白、趋化因子共受体结合在一起进入细胞内[3-4]。在外周神经系统的背根神经节神经元(DRG)，gp120可直接入侵继而引发神经元发生变性，影响神经元的超微结构或活性活性。研究表明[5]，gp120体外实验具有神经毒性，外周或者中枢施用gp120足以引发疼痛。伤害感受器在接收到外界刺激后，引起初级传入神经末梢兴奋，细胞膜去极化形成的向中枢神经系统传递电流(动作电位)而形成人类的痛觉。简单的说，位于伤害感受器上离子通道和特定的分子的共同作用，产生了疼痛的感觉。

Kv是广泛分布的的一类电压门控性离子型通道，神经元动作电位产生和传播是其活化的结果，在疼痛发生及传递过程中发挥着重要的作用。Kv2.1、Kv4.2分别是外向延迟整流钾通道(TEA 敏感型)和瞬时外向钾通道(4-AP 敏感型)的主要成分，均存在于DRG神经元中[6-7]。有研究表明[8]，β淀粉样蛋白片段可作用于瞬时外向钾通道Kv4.2，使其表达上调，引起外向电流的增大。本研究结果表明，与对照组相比，gp120模型组大鼠Kv4.2的蛋白表达明显降低，提示Kv4.2可能参与gp120所致的HIV相关病理性疼痛过程的发生。本研究未发现gp120模型组大鼠Kv2.1的蛋白表达发生改变，提示Kv2.1可能不参与该过程。综上所述，Kv4.2可能参与gp120所致的神经病理性疼痛，其具体分子机制尚需进一步研究。