儿童腺病毒肺炎外周血单个核细胞中转录因子RORγt mRNA的表达意义

张伦敏，张 翔

(遵义市第一人民医院/遵义医科大学第三附属医院，贵州 遵义 563003)

人腺病毒(Human adenovirus，HADV)肺炎由腺病毒(ADV)感染所致,其临床特点起病急、高热持续时间长、中毒症状重[1].好发于6个月至5岁儿童，是较为严重的儿童社区获得性肺炎[2]，临床上大约有1/3 的腺病毒肺炎因各种原因转变为重症腺病毒肺炎[3]。重症肺炎是小儿危重症疾病之一，通常进展快，全身中毒症状重[4]。目前发病机制尚未完全清楚，但认为与病毒血清型、滴度以及宿主的免疫应答能力相关[5]，辅助性T细胞17(Th17)是一类主要分泌IL-17 A、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子Th 细胞亚群，并通过这些细胞因子在机体的免疫反应中发挥重要的生物学功能，是最早参与抗感染免疫应答的效应性T细胞，同时在介导慢性炎症、自身免疫病和肿瘤发病中也具有重要作用，孤独核受体γt(Orphan nuclear receptor gammat，RORγt)是调控Th17细胞分化的特异性转录因子，很大程度上决定着Th17细胞的分化、发育，无论是体内Th17细胞介导的炎症反应还是体外细胞因子诱导Th17细胞的分化都需要RORγt的参与。其表达水平的高低可以直接反映Th17细胞功能状态。本研究拟检测儿童腺病毒肺炎外周血单个核细胞(PBMCs)中Th17细胞特异性转录因子RORγt的表达水平，探讨儿童腺病毒肺炎的免疫发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例组全部来源于本院儿科住院患儿30例，其中男性患儿17例，女性患儿13例；年龄3个月至12岁，平均(5.2±2.0)岁。对照组30例为健康体检儿童，其中男性儿童18例，女性儿童12例，年龄1～11岁，平均(6.2±3.1)岁。病例组与对照组在年龄、性别构成上差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)符合《儿童腺病毒肺炎诊断标准》[2]；(2)病原学检测为腺病毒；(3)治疗前个1月未使用影响免疫系统功能类药物。排除标准：(1)患有其他自身免疫系统疾病；(2)合并有严重肝、心、肾疾病及恶性肿瘤疾病。

1.2 试剂和仪器 Trizol(Invitrogen公司)，淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技公司)，PCR仪器(Eppendorf公司)，核酸蛋白微量分析仪(Thermo公司)逆转录反应体系试剂盒、Real-TimePCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，DNA Marker( TaKaRa公司)，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)，β-actin、RORγt引物均由宝生物工程(大连)工程有限公司合成(见表1)。

表1 检测基因与对应的引物序列

1.3 方法 抽取空腹患儿及正常健康儿童外周血3 ml，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA样品2 μl放于核酸微量分析仪下测其RNA的浓度及OD260/OD280值(以DEPC水调零)进行纯度鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。反转录条件为：37℃ 15 min；85℃ 5 s。Real-time PCR 反应条件：变性(95℃，3 min)；退火(95℃，5 s)；延伸(60℃，30 s)；循环(40 cycles)。各样本相对表达量采用国际通用的相对定量法(2-ΔΔCT法)进行统计分析，以Ct值为统计参数依次计算下列数据：△△Ct=(Ct目的-Ct内参)病例组-(Ct目的-Ct内参)对照组，目的基因相对于某基因的表达量=2-ΔΔCT。

2 结果

RORγt mRNA部分标本QRT-PCR扩增产物电泳(见图1)。β-actin、RORγt基因的Real time PCR扩增产物单一，熔解曲线未见杂峰，均为单一峰，扩增曲线拐点清楚，指数期明显，排除了非特异性扩增和引物二聚体，扩增产物较好(见图2～5)。

病例组外周血PBMCs中RORγt mRNA的表达水平为(5.30±3.95)，对照组为(1.11±0.50)，病例组明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义(t=-5.75，P<0.001)。

3 讨论

腺病毒属于DNA病毒，分为A、B、C、D、E、F、G 7个亚群，90个血清型[6],主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强。HADV-3、HADV-7型腺病毒在我国最常见，其中HADV-7型最容易发生重症肺炎和死亡，目前该发病机制尚不完全清楚，但认为与病毒血清型、滴度以及宿主的免疫应答能力相关[7]。已有研究证实CD4+T细胞能识别腺病毒衣壳蛋白[8],具有免疫应答正性调节功能，其中Th1细胞主要分泌IFN-γ，IFN-α、IL-2等细胞因子增强抗感染能力，Th2细胞主要分泌IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子辅助B细胞活化参与机体体液免疫。两者之间相互抑制增殖，由此说明Th1与Th2细胞比例的失衡可能参与到病毒感染的发生[9]，随着分子免疫学研究的逐步深入，发现Th1/Th2平衡失调并不能完全阐明腺病毒肺炎的发病机制。

Th17 细胞是一类不同于Th1、Th2细胞的CD4+T 细胞另一亚群，其主要分泌IL-17A、IL-17F细胞因子，IL-17是最重要的效应因子，IL-17具有促进炎症作用的细胞因子[10]，尤其在炎症早期，能够诱导促炎因子(如TNF、IL- 6)、趋化因子(如MPC1和MIP2)和基质金属蛋白酶的表达，引起组织细胞的浸润和组织破坏。除此之外，IL-17还参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，对T细胞的活化起协同刺激作用[11]。RORγt作为Th17细胞的特异性转录因子，在Th17细胞的分化、发育中起重要作用，RORγt诱导Th17细胞的分化并调节IL-17的表达，若抑制RORγt 的表达，则能够抑制未致敏T细胞向Th17细胞分化。

目前关于转录调节因子RORγt mRNA与儿童腺病毒肺炎发病关系的报道较少，本研究通过检查儿童腺病毒肺炎外周血中Th17细胞中RORγt mRNA表达水平，探讨RORγt mRNA在儿童腺病毒肺炎发病机制中的作用。实验结果显示对照组外周血中转录因子RORγt mRNA表达水平显著高于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.001)。表明儿童腺病毒肺炎Th17细胞在CD4+T辅助细胞中所占的比例上升，RORγt的高表达可能促进了Th17细胞分化，通过调节IL-17等致炎因子的分泌参与了儿童腺病毒肺炎的发生，提示Th17细胞及其特异性转录因子RORγt与儿童腺病毒肺炎发生发展密切相关，并在儿童腺病毒肺炎的免疫致病机制中发挥重要作用，但是RORγt在儿童腺病毒肺炎发病过程中更深层的作用及与其他转录因子表达影响还有待进一步研究。