两种天然防腐剂对单增李斯特菌抑菌性的研究

张鑫，李迎秋

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

天然防腐剂和化学防腐剂是两类食品防腐剂[1]。化学防腐剂能有效地控制食品致病菌的生长繁殖，目前已经广泛应用于食品工业中，但是化学防腐剂存在的潜在毒性不能忽视，而天然防腐剂具有安全无毒、热稳定性高等优点[2]。因此，研究和开发天然防腐剂成为近年来的热点和难点。

大豆球蛋白碱性多肽(GBP)是从豆粕中提取分离得到的具有抑菌性的阳离子多肽[3]。GBP对于牛奶中的肠炎沙门氏菌、单细胞李斯特菌等致病菌有显著的抑菌效果，可延长牛奶的保质期[4]。Li等研究了GBP对在4 ℃条件下冷藏猪肉的保鲜效果，结果表明0.16%和0.20%的GBP显著地抑制了细菌的生长繁殖，延长冷藏猪肉的保质期长达6 d[5]。乳酸链球菌素(Nisin)是从微生物中提取的一种天然抗菌肽，由34个氨基酸组成。对于李斯特菌等革兰氏阳性菌有良好的抑菌效果[6]，被人体消化道酶降解成氨基酸，对人体安全无毒。大多研究表明，它能有效抑制引起食品腐败的大范围的革兰氏阳性细菌(尤其是亲缘性较近的细菌)[7]，如乳杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、李斯特氏菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，尤其对产生芽孢的革兰氏阳性细菌有特效，而对革兰氏阴性菌作用不大，对酵母菌和霉菌没有作用[8]。

此外，乳酸链球菌素对梭状芽孢杆菌的抑制作用显著，可应用于肉制品工业中。Mangalassary等研究了巴氏杀菌低脂火鸡腊肠过程中使用乳酸链球菌素对单细胞增生李斯特菌失活时间的影响，结果显示乳酸链球菌素有效缩短了目标菌失活所需的时间[9]。目前认为抗菌肽的抑菌机理有两种：一是抗菌肽通过静电相互作用与细胞膜结合导致其结构破坏[10]；二是抗菌肽不仅破坏细胞膜，而且能破坏细菌细胞内的核酸和蛋白质大分子物质从而影响细胞生理活动[11]。

李斯特菌能感染肉类、蛋类、海产品、乳制品等绝大多数食品。由于大量的抑菌剂在食品生产过程中广泛使用，造成李斯特菌的抗性增强，使得在食品生产过程中如何抑制李斯特菌的生长成为一个难题。食品企业科学、合理、适量地添加化学防腐剂并不会对人体产生危害，然而超标、超量、超范围添加则很容易造成食品安全隐患。而GBP与Nisin两种天然防腐剂安全性能高，功能价值高，抑菌性好。通过比较GBP与Nisin抗李斯特菌特性，可以更好地选择更加优良的抗菌剂应用到食品防腐工业中。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

大豆球蛋白碱性亚基(GBP)、乳酸链球菌素(Nisin)：购自实验室；李斯特菌(Listeriamonocytogenes)：从齐鲁工业大学菌种保藏中心获得；其余试剂均为分析纯。

1.2 菌种及培养基

李斯特菌ATCC19115：齐鲁工业大学菌种保藏中心；脑心浸液肉汤培养基(培养李斯特菌)。

1.3 培养基及溶液的配制

将单增李斯特菌接种于脑心浸液肉汤琼脂斜面，37 ℃培养24 h，挑取单菌落，接种于已灭菌的脑心浸液肉汤液体培养基中，在37 ℃，150 r/min条件下摇床培养10 h左右，菌悬液浓度达到107CFU/mL，生长达到稳定期，实验备用。

灭菌生理盐水：配制一定浓度的生理盐水灭菌备用。

2 实验方法

2.1 最小抑菌浓度(MIC)的测定

GBP和Nisin对李斯特菌的抗菌活性可通过稀释法进行测定[12]。李斯特菌培养至菌液浓度约为107CFU/mL，将不同浓度的GBP和Nisin分别加入到菌悬液中，GBP和Nisin终浓度分别为25，50，100，200，300，350，400，450 μg/mL，以菌悬液作为阳性对照，液体培养作为阴性对照，在37 ℃振荡培养24 h，通过测定各组样品在OD600 nm处的吸光度来比较GBP和Nisin的抑菌特性，每组平行做3次。

2.2 李斯特菌细胞内RNA及蛋白类泄露的测定

李斯特菌培养至对数末期，将100 mL菌液平均分装在4个离心管里，在6000 r/min条件下离心20 min，无菌生理盐水洗涤2次并放入3 mL的生理盐水，将不同浓度的GBP和Nisin分散液加入到菌悬液中，GBP终浓度为0，200，400 μg/mL，Nisin终浓度为0，400，800 μg/mL，在恒温摇床培养箱中37 ℃，150 r/min条件下培养，分别在培养0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min条件下离心5 min，保留上清液冷冻保藏。用紫外可见分光光度计分别在260，280 nm处检测其上清液的吸光度[13]，并绘制相应曲线。

2.3 李斯特菌细胞内还原糖泄露的测定

将李斯特菌培养至菌液浓度约为107CFU/mL，以10 mL菌液量进行分组，在6000 r/min离心20 min收集李斯特菌菌体，用灭菌生理盐水洗涤细胞2次。并加入到9 mL灭菌生理盐水后，将不同浓度的GBP和Nisin分散液加入到菌悬液中，GBP终浓度分别为0，200，400 μg/mL，Nisin终浓度分别为0，400，800 μg/mL，分别在培养0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min条件下离心5 min，保留上清液冷冻保藏。用还原糖测定仪分别测定样液中还原糖的含量。

3 结果与讨论

3.1 最小抑菌浓度(MIC)的测定

GBP和Nisin对单增李斯特菌的最小抑菌浓度见表1。

表1 GBP和Nisin对单增李斯特菌的最小抑菌浓度测定Table 1 The MIC of GBP and Nisin against Listeria monocytogenes

由表1可知，GBP浓度为100 μg/mL时，无菌生长；在Nisin浓度达到400 μg/mL时，无菌生长，说明GBP和Nisin对李斯特菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为100，400 μg/mL。GBP和Nisin对李斯特菌都具有良好的抑菌效果，但GBP对李斯特菌的抑制效果明显强于Nisin对李斯特菌的抑制效果。

3.2 李斯特菌细胞内RNA及蛋白类泄露的测定

经两种抗菌肽处理对李斯特菌RNA泄露的影响见图1和图2；经两种抗菌肽处理对蛋白质泄露的影响见图3和图4。

图1 GBP对李斯特菌RNA泄露的影响Fig.1 The effect of GBP on RNA leakage of Listeria monocytogenes

图2 Nisin对李斯特菌RNA泄露的影响Fig.2 The effect of Nisin on RNA leakage of Listeria monocytogenes

图3 GBP对李斯特菌蛋白泄露的影响Fig.3 The effect of GBP on protein leakage of Listeria monocytogenes

图4 Nisin对李斯特菌蛋白泄露的影响Fig.4 The effect of Nisin on protein leakage of Listeria monocytogenes

李斯特菌细胞内的核糖体是由RNA和蛋白质共价合成，RNA和蛋白质对细胞的生命活动有着不可缺少的重要作用。蛋白质是细胞重要的结构组成成分，而核糖体具有合成蛋白质的功能，所以RNA和蛋白质这两种物质对李斯特菌细胞的生命活动起着重要的作用。测定RNA和蛋白质成分的最大吸光值分别在OD260 nm处和OD280 nm处，因此，可以通过紫外分光光度计在这两个波长下测定细胞外是否出现RNA和蛋白质成分[14]。

由图4可知经不同浓度GBP和Nisin处理的李斯特菌的RNA及蛋白质成分溶出情况。同一时间，OD值分别随着两种抗菌肽浓度的升高而增大，表明抗菌肽浓度越高，RNA与蛋白质泄露也在增多；同一浓度下，随着时间的累积，吸光值也不断增大，说明RNA与蛋白质不断从细胞膜内流出。

由图1～图4可知，同一时间，在抗菌肽浓度为400 μg/mL时，经Nisin处理的样液的OD值要高于GBP处理的OD值，样液的RNA及蛋白质成分流出量更多。由此得出GBP与Nisin两种抗菌肽使李斯特菌的RNA及蛋白质泄露的膜作用方式不同。初步推断，GBP作用于细菌的细胞膜上，干扰细胞正常生理活动，从而抑制菌体生长；而Nisin通过破坏李斯特菌的细胞膜结构，使其通透性增大，从而导致RNA及蛋白质成分从膜内流出，造成菌体的死亡，抑制李斯特菌的生长。

3.3 李斯特菌细胞内还原糖泄露的测定

GBP和Nisin对李斯特菌还原糖含量的影响分别见图5和图6。

图5 GBP对李斯特菌还原糖含量的影响Fig.5 The effect of GBP on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

图6 Nisin对李斯特菌还原糖含量的影响Fig.6 The effect of Nisin on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

当在OD260 nm和OD280 nm下测定细菌的吸光度时，由于细菌表面物质的自然泄露，无论是否加入抗菌肽，都会导致吸光值变大。可以通过测定李斯特菌细胞内还原糖的泄露量来反映GBP与Nisin对李斯特菌细胞膜的破坏作用。

由图5和图6可知，与对照组细菌细胞菌悬液中还原糖相比，经两种抗菌剂处理的样本中还原糖含量明显上升。在3 h之内，随着GBP与Nisin抗菌肽的浓度增大，还原糖含量也分别迅速上升。在抗菌剂浓度为400 μg/mL时，经Nisin处理的菌悬液测定的还原糖含量(见图6)要高于经GBP处理的还原糖含量(见图5)。

4 结论

实验结果表明，GBP与Nisin两种抗菌剂都能够有效抑制李斯特菌的生长，GBP和Nisin抑制李斯特菌生长的最小抑菌浓度分别是100，400 μg/mL，GBP的抑菌效果要强于Nisin。两种天然抗菌肽都能造成其细胞膜结构的损伤，并损伤胞内蛋白及RNA遗传物质等成分。此实验只是对李斯特菌的抑菌机制机理做了初步的研究比较，更深层次的抑制机理的研究有待探索，例如对蛋白质和碱性磷酸酶合成的影响，对细胞膜造成的破坏等。