功能性低聚糖的研究进展及应用现状

邹月，黄金凤，魏琴

(1.西华大学 食品与生物工程学院，成都 610039; 2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000)

1983年，日本人首次发现功能性低聚糖不能被人体消化却能被肠道内细菌选择性利用的特性后开启了益生元工业化生产的道路。2009年11月1日，中国第一个与益生元产品相关的国家标准《低聚果糖》正式实施，至此我国益生元产业高速发展。随着益生元来源及应用越来越广，Gibson等[1]在2016年将益生元重新定义为：能够被宿主微生物选择性利用从而带来健康益处的物质。虽然益生元与益生菌功能相似，都能改善肠道菌群比例，但益生菌在实际使用时需要考虑外来益生菌到达肠道时存活率和定植问题，益生元则不需要考虑这些，摄入后选择性地促进肠道中有益微生物生长和代谢维持人体肠道菌群平衡[2-3]。目前对益生元的研究主要针对功能性低聚糖、多糖、微藻类，常将其添加到食品中开发具有独特功能的产品。

低聚糖是由2～10个单糖分子经糖苷键连接而成的低度聚合糖，按照有无生理功效可分为普通低聚糖和功能性低聚糖[4]。普通低聚糖能直接被人体消化、吸收，功能性低聚糖无法被上消化道分解，通过在肠道中发挥其独特的生理功能来维持宿主健康。一般认为功能性低聚糖能特异性地诱导肠道中双歧杆菌生长，促进双歧杆菌发酵产生大量短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，并抑制有害菌生长繁殖，降低有害菌和毒素在肠膜的附着力。此外，研究人员还证明了功能性低聚糖在免疫调节、抗炎活性、促进营养物质吸收、降低胆固醇和调节肠道渗透压等方面功能。

1 功能性低聚糖常见制备方式和研究现状

目前除直接从天然产物中提取功能性低聚糖外，工业上主要利用单糖合成或多糖降解的手段制备功能性低聚糖。

由表1可知，常见功能性低聚糖制备方法有6种，下面主要对工业上常用的3种方式：酶合成法、微生物发酵法和酶降解法进行介绍。

表1 常见功能性低聚糖来源及制备方法Table 1 The sources and preparation methods of common functional oligosaccharides

1.1 酶合成法

酶合成法是使用糖基转移酶对底物进行转化，合成功能性低聚糖的方法。目前主要运用于GOS、OsLu、FOS这些已经广泛作为食品辅料、临床医药和保健品领域的益生元合成。一些常用酶制剂往往同时具有降解酶和糖基转移酶活性。例如，将β-半乳糖苷酶加入乳糖液时，若半乳糖基的受体为水，就会发生乳糖的降解反应，释放半乳糖和葡萄糖；如果半乳糖基的受体是乳糖，就会催化糖基供体底物中的糖残基转移到受体，形成新的糖苷键，通过一次或多次的转移半乳糖基化，最后形成不同结构的GOS混合物[9]；菊粉酶既可将菊粉降解为FOS和菊糖低聚糖，也可以蔗糖作为底物合成FOS(蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖)。酶合成法生产功能性低聚糖分为两步：微生物生产具有糖基转移活性的功能性低聚糖合成酶；将纯化酶加入底物中生产功能性低聚糖。不同微生物来源获得的同种酶合成的功能性低聚糖结构有很大不同。研究人员从米曲霉β-半乳糖苷酶产生以Gal-β(1→6)-Gal-β(1→4)-Glc为主的9种混合GOS化合物[10];从芽孢杆菌突变β-半乳糖苷酶合成的GOS混合物中鉴定出14种新的GOS化合物。工业上为提高酶合成功能性低聚糖的产率，除优化温度、pH、底物浓度等条件外，还利用基因工程技术修改野生酶糖苷配基位点或增强酶活性中心疏水性，得到活力高、稳定性好的突变酶。

我国工业上生产低聚果糖、低聚半乳糖时主要采用酶合成法。目前量子高科在固定化果糖基转移酶法生产蔗果低聚糖方法基础上，自主研发出最新的“第三代固定化果糖基转移酶技术”生产FOS，该法所生产的FOS一次转化率可达55%～60%。2013年该公司募投的10000 t低聚果糖扩产项目已顺利投产。保龄宝生物股份有限公司建立的年产5000 t低聚半乳糖项目也于2016年顺利投产。

1.2 微生物发酵法

微生物发酵法又称为一次发酵法，是在底物中加入能将其合成为功能性低聚糖的微生物，同时获得酶和功能性低聚糖的方法，这省去了生产和纯化酶步骤，工业生产功能性低聚糖成本显著减少。舒丹阳等在草石蚕原料中接种0.01%黑曲霉和0.01%乳杆菌的混菌发酵组合，发酵36 h，进行一系列精制纯化后可得纯度高达78.13%的水苏糖。 然而微生物发酵法得到的产物中除了我们所需功能性低聚糖外还含有大量无益生作用的糖(以葡萄糖和底物为主)，这些糖不仅会抑制糖基转移反应，降低产量，还会制约功能性低聚糖的益生效果。最近研究发现，使用功能性低聚糖产生菌和酿酒酵母共培养法生产功能性低聚糖时能显著提高功能性低聚糖的纯度。Nobre等[11]将曲霉菌，酿酒酵母YIL162W和底物加入发酵罐中在温度30 ℃，pH 6.0的条件下反应53 h，可生产出纯度高达(93.8±0.7)% (W/W)FOS混合液。然而，除日本以外，其他国家很少有完全掌握微生物发酵法产业化技术的企业，且在食品生产过程中，酶合成法较微生物发酵法更具有安全性、稳定性，因此微生物发酵法使用率较低。

1.3 酶降解法

天然多糖通常具分子量过大、粘度高、结构复杂等特点，导致其生物活性无法有效发挥，使用生物、化学和物理等手段均可使其获得更强的生物活性。随着可持续发展意识的增强，研究人员开始将注意力转移到农副产品的开发利用上。农副产品中含有大量具有可降解为功能性低聚糖的多糖，如苹果渣、柑橘皮、甜菜渣中含有果胶；玉米芯、稻壳、秸秆中含有木聚糖。通过将这些废弃物中大分子多糖降解为所需的功能性低聚糖是如今学术界和工业界的研究重点。其中XOS的双歧因子功能是其他功能性低聚糖的10～20倍，对双歧杆菌和青春芽孢杆菌有极强的促生效果，被认为是最有潜力的益生元。山东龙力生物科技作为国内首家实现低聚木糖工业化生产的企业，该公司使用酶法降解玉米芯，低聚木糖年产量可达4000 t左右。与化学降解法和物理降解法相比，酶降解法条件更为温和，产物可控性强，专一性强，是通过降解多糖制备功能性低聚糖最常用的方法之一，因此研究人员常使用酶降解法降解农副产品。Hong等研究芒果木质纤维素酶解液益生作用时发现，使用疏水树脂纯化的水解液显示出对乳酸菌较强的促生效果。Baldassarre等[12]在酶膜反应器中，利用50 g/L洋葱皮粗果胶提取物，在温度45 ℃、酶浓度41.4 U/mL、反应时间15 min的条件下，可获得最高POS体积产率22.0 g/(L·h)。酶降解法能快速大量地获得所需功能性低聚糖，具有广阔的开发前景，然而生产中会得到大量副产物，如何降低高昂的后续分离纯化成本是工业上运用此法最大的难题。

1.4 其他制备方法

除上述方法外，为探索一种快速、高效、环保的单糖合成低聚糖工艺，Liu等[13]提出快速淬火转化法(sharp-quenching thermo conversion, SQTC)，该法将单糖放进管式反应器后升温到最佳热转换温度再经过反应初期、低聚糖形成期和活性反应后期3个阶段，并以空气或氮气作为淬火介质，可短时间获得40%左右的低聚糖。在研究降解天然多糖方法时，研究人员常结合多种方法制备低聚糖。例如Jian等[14]采用γ射线辐照与酶解相结合的方法将魔芋葡甘聚糖降解为魔芋低聚葡甘聚糖；朱新锋等[15]发现使用撞击流法可有效将较低浓度的壳聚糖降解为低聚壳聚糖。

2 功能性低聚糖生理活性研究现状

2.1 调节肠道微生物

大量临床研究表明，健康受试者服用功能性低聚糖后会促进肠道中双歧杆菌生长。Endo等[16]通过粪便发酵实验评价1-Kestose对健康人肠道微生物群的影响，16S rRNA基因测序和定量PCR检测结果均显示1-Kestose组长双歧杆菌水平明显高于对照组，大肠杆菌明显低于对照组，这表明1-Kestose可能是通过促进益生菌繁殖和抑制致病菌生长来调节肠道健康。这可能是双歧杆菌作为肠道优势菌后通过种间竞争间接抑制其他微生物生长，且益生菌发酵低聚糖时产生的SCFAs导致肠道中pH下降，这也会进一步抑制某些细菌。研究人员还发现在机体患病情况下摄入低聚糖，能监测到与疾病相关的细菌繁殖受到抑制。Wang等[17]研究表明，MOS能降低与炎症和肥胖相关的几种细菌，如Oscillospiraspp.，Coprococcusspp.和Ruminococcusspp.的相对丰度。此外，Yang等[18]还证实GOS能修复小鼠因饮酒而导致肠道微生物群失调，消除外周血中过量的内毒素。

2.2 抗炎活性

炎症是机体在应对外界不良刺激时发生的一种自动防御反应。通常情况下炎症是对人体有益的，然而过激的炎症反应会使人患上炎症性疾病。其中炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)就是在免疫、环境、遗传和药物感染等因素刺激下使肠道黏膜免疫系统异常导致的发炎反应[19]。作为一种新型的生物制剂，功能性低聚糖制剂可通过调节炎症标志物缓解IBD症状。Sun等[20]利用人结肠上皮细胞和脂多糖(LPS)建立结肠炎模型研究GOS对结肠炎相关的miRNAs调节作用，发现GOS预处理使miR-19b表达显著上调，炎症因子TNF-α、IFN-α和IL-1α释放被抑制，LPS诱导的细胞损伤症状得到缓解。当miR-19b被沉默时，GOS体外和体内结肠保护作用均减弱。这表明GOS在一定程度上可以通过上调miR-19b预防结肠炎。据报道，大约50%接受化疗或放疗的癌症患者会患上粘膜炎[21]，Galdino等[22]探索FOS对5-氟尿嘧啶(5-FU)所致肠黏膜炎的治疗作用时发现，小鼠食用FOS后髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和嗜酸性粒细胞过氧化物酶(eosinophil peroxidase,EPO)活性均降低，表明FOS可通过减少小鼠肠膜上中性粒细胞和嗜酸性粒细胞来减轻炎症反应。最近还发现FOS可通过降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生和肝细胞凋亡来改善炎症反应[23]。综上，随着人们对IBD病因和发病机制的研究逐渐深入，功能性低聚糖在治疗IBD的作用机制还处于探索阶段，其有效性还需通过临床实验进一步验证，但将其作为治疗IBD药物的应用前景仍十分广阔。

2.3 免疫调节

肠道不仅是人体最大的消化器官，也是人体最大的免疫系统。功能性低聚糖到达肠道后可通过促进抗体形成和细胞因子释放来增强机体免疫功能。Genda等[24]研究食用低聚果糖的大鼠盲肠内免疫球蛋白(IgA)浓度变化机制结果显示，短期摄入FOS(7 d或9 d)可显著提高盲肠IgA浓度且伴随着促炎细胞因子和多聚免疫球蛋白受体(pIgR)表达增加而升高。花生过敏者和服用免疫抑制剂的人群也可通过食用功能性低聚糖来增强免疫效应[25]。此外，由于双歧杆菌本身具有复杂的增强机体免疫功能的能力，功能性低聚糖还可通过促进双歧杆菌繁殖间接调节肠道内免疫活性。

2.4 促进营养物质吸收

由于功能性低聚糖的摄入，肠道中SCFAs增加，pH降低，矿物质溶解度增加，这极大地帮助了人体对矿物质的吸收，因此以GOS和FOS为主的功能性低聚糖在促进机体对钙、铁、镁和无机磷等矿物质吸收的生理活性被科研人员广泛关注。Marciano等[26]评价低聚果糖对生长期缺铁性贫血大鼠铁吸收调节因子的影响，发现FOS可能是通过降低十二指肠铁蛋白表达和降低盲肠中IL-10、IL-6和TNF-a因子浓度来调节贫血大鼠铁的吸收。Seijo等[27]研究证实，不同链长的GOS/FOS混合物能诱导近端结肠(吸收钙)和远端结肠(吸收镁)中肠道细菌连续发酵，提高矿物质的吸收效率，通过增加骨骼矿化、密度和结构来维持骨健康。最近有报道显示，功能性低聚糖除了能增加机体对矿物质的吸收能力外，还能通过提高对黄酮类化合物的吸收能力来增强机体的抗氧化活性[28]。

2.5 改善糖尿病症状及其他

Ⅱ型糖尿病作为一种中老年常见慢性病，主要与胰岛素水平低或胰岛素抵抗相关。目前，治疗糖尿病的药物主要有胰岛素及其类似物、磺酰脲类促泌剂、二甲双胍类等。常用药物相关的副作用限制了它们在临床治疗中的应用，急需寻找其他副作用较少的降糖药物。功能性低聚糖具有多种抗糖尿病作用机制，包括改善胰腺功能、抑制α-葡萄糖苷酶、减轻胰岛素抵抗、抗炎作用、调节肠道微生物群和激素等，减少其他糖尿病危险因素是一种潜力极大的降糖药物替代品。Zheng等[29]研究证实壳寡糖可通过抑制肠道α-葡萄糖苷酶和葡萄糖转运蛋白SGLT1和GLUT2表达，逆转胰岛素抵抗来发挥抗糖尿病作用。

功能性低聚糖还具有保护肠道屏障、调节脂质代谢、护肤、缓解便秘等生理活性。例如，Wu等[30]研究FOS对肠黏膜屏障的直接影响时发现，在没有微生物的情况下，FOS可通过激活肠上皮细胞中蛋白激酶C-δ活性直接发挥屏障保护功能；Hashmi 等[31]利用乳糖液合成的GOS喂养高胆固醇雌性大鼠，与对照组相比，GOS喂养大鼠的血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇显著降低。此外，GOS还被证实具有增强皮肤保湿和抑制黑色素积累的能力[32]，可作为护肤品的天然替代品应用。

3 功能性低聚糖应用现状

3.1 在食品领域的应用

随着消费者对食品安全及功能的要求升级，益生元及其制品的开发应用一直是食品行业的研究热点。目前，世界上益生元食品的研发和应用由几个龙头企业领头，如日本的Meijika Kaisha、比利时的Beneo-Orafti、荷兰的Friesland Campina和中国的量子高科等。功能性低聚糖作为一种甜度较低、溶解度高的碳水化合物益生元，研究人员将其加入发酵乳制品、饮料、保健品、烘培等食品中开发具有一定功能的食品。由于不同功能性低聚糖在结构、组成、性能上有差异，导致不同功能性低聚糖对益生菌的促生能力有所不同。Li等[33]使用乳酸杆菌评估10种常用于人类饮食中商业益生元的益生活力。结果显示，以在葡萄糖上生长的菌株作为对照，仅乳糖醇、GOS和FOS能促进菌株生长，在其余益生元上菌株生长受到抑制。而Delgado-Fernandez等[34]在制作合生发酵乳时发现，由于原料乳中本身含有乳糖，功能性低聚糖并不会参与发酵乳的发酵和贮藏过程，反而能将其作为食品基质到达远端结肠，改善肠道微生物组成。在食品中功能性低聚糖除作为双歧因子存在外，功能性低聚糖还能作为食品添加剂加入食品中改善食品的质构、热量和风味。例如，FOS既能作为蔗糖替代品赋予食物甜味，还能作为脂肪替代品生产低热量食品，在干酪中加入FOS能生产出结构更紧密的奶酪[35]。此外，因功能性低聚糖具有抗菌性和抗氧化活性，研究人员还将其制成可食性涂膜应用于水果的储藏保鲜中。

表2 部分商业化功能性低聚糖食品Table 2 Some commercial functional oligosaccharide food

3.2 在饲料领域的应用

抗生素作为一类在低浓度下就对病原微生物具有抑制或杀灭的重要药物，曾广泛应用于畜禽饲料生产中。然而长期、大剂量摄入抗生素会导致畜禽免疫力下降，还能让病原菌产生耐药性，养成超级细菌，甚至严重的药物残留还会威胁到人体健康。近些年来，许多国家都开始限制甚至禁止抗生素在动物饲料中的使用，我国农业农村部也要求，2020年猪饲料中将全面禁止添加抗生素。功能性低聚糖作为部分抗生素替代品开始被加入鱼类、仔猪、肉鸡等动物日粮中进行相关研究。研究人员通过对比仔猪食用添加250 mg/kg抗生素(100 mg/kg硫酸粘杆菌素、100 mg/kg喹乙醇和50 mg/kg北他霉素)或800 mg/kg奇力素TM(富含甘露聚糖)饲料28 d的效果，发现与抗生素组相比，添加奇力素TM对腹泻和死亡率的影响与抗生素相似，且猪肠道形态更健康[36]。Lu等[37]首次对草鱼食用添加甘露寡糖饲料的效果进行研究，结果表明，饲料中添加适量MOS(200～600 mg/kg)可以改善草鱼的生长性能，保护肠道结构的完整性，从而促进肠道健康(肠道生长、肠道菌群和SCFAs)，增强抗氧化能力。为充分发挥功能性低聚糖的效果，研究人员还将功能性低聚糖与益生菌混合制成合生饲料，也有人将其与挥发性精油混合来调节肉鸡和牛犊的生长性能[38]；在市面上售有名为“功能性低聚糖863”的混合型饲料添加剂，以XOS、低聚麦芽糖、甘露寡糖为主要成分，适用于鱼类、虾类、贝类等海淡水养殖动物，具有调节肠道细菌平衡，预防细菌病毒疾病发生，促进营养转换等功效。尽管功能性低聚糖作为一种饲料添加剂能使动物保持健康，促进生长，但还不清楚功能性低聚糖对肠胃中具体哪些微生物造成了影响，发生了哪些代谢反应，需要使用分子生物学技术解释这些复杂的关系才能更加准确地将功能性低聚糖应用于饲料行业中。

3.3 在农业中的应用

研究人员常将功能性低聚糖作为外源诱导子，刺激农作物在遇到病原体入侵或害虫啃食时启动防御反应。Ma等[39]利用蛋白组学技术评价了COS对尖孢镰刀菌引起的水稻幼苗枯萎病的影响。结果表明，COS可通过刺激水稻根部二萜类化合物生物合成途径中差异蛋白的表达，促使相关酶活性提高和抗菌物质稻壳酮积累，尖孢镰刀菌对水稻根系生长的抑制作用得到缓解。Li等[40]施用50 μg/mL浓度的COS用于茶树叶片上，可诱导茶树对炭疽病的抗病性。与传统化学农药相比，功能性低聚糖具有安全、无毒和环境友好等特点，在保护农作物的同时还能解决农药残留和害虫抗药性等问题，是一种理想的生物农药候选物。近年来国内生物农药技术的研发获得重大突破，以壳寡糖为代表的功能性低聚糖农业产品逐年增多，如江西正邦作物、青岛博智汇力、山东海龙元等公司均推出以农业级壳寡糖为有效成分具有抑制病原菌，提高抗逆性，改善作物品质等功能的生物农药，湖北维纳施生态工程有限公司推出为促进作物光合作用，广谱抑菌的壳寡糖复合肥料17-7-27-维纳施。作为一个人口和农业大国，生态环保型农药、肥料的市场潜力极大，开发利用功能性低聚糖，以生物方法解决农业中遇到的问题一直是我国学者和生物公司研究的热点。

4 展望

随着功能性低聚糖在肠道微生态中生理功能研究加深，功能性低聚糖在食品、饲料和农药等领域需求量逐渐增大。现阶段高纯度功能性低聚糖生产成本高，产率低，急需从以下几个方面提升和发展。第一，筛选、诱变功能性低聚糖生产菌。微生物合成法是工业上生产功能性低聚糖的常用方法，产率不高和产物高度非均质性是目前、的主要困难。使用基因工程技术针对性地对野生菌进行诱变后通过筛选得到高产菌，可能是解决这些问题的最优手段。第二，提高工业生产自动化程度。稳定性和可重复使用性是目前工业生产功能性低聚糖的基本要求。结合宏观动力学模型和固定化酶重复间歇操作可以全局和局部地对生产实现最优控制，是未来工业化生产功能性低聚糖的方向。第三，探究多糖水解方法。解决天然多糖降解物复杂，纯化和结构鉴定困难这些问题也是目前研究的热点[41]。第四，纯化方法研究。纯度过低的功能性低聚糖会直接削弱其生理活性发挥。目前工业上常用膜分离技术、微生物处理、模拟移动床、吸附法等纯化技术进行纯化，这些纯化技术可使得部分低聚糖纯度为95%以上，但随着纯度的增高，对厂家生产技术和设备的要求相应提高，国际上仅日本和中国拥有几家能规模化生产高纯度功能性低聚糖的厂家。

为了帮助功能性低聚糖在食品、饲料、农业等领域更好应用，一方面需要尽快形成一套完整的功能性低聚糖安全性评价体系。另一方面，对现有功能性低聚糖结构特性进行表征，包括聚合度、糖苷键类型、单糖谱等，建立结构与功能之间的关系，使产品标准化，这样才能使商业化的功能性低聚糖产品产生更多收益。