盐渍处理对洋葱挥发性风味物质的影响及其机制研究

黄俊僮，陈永丽，蓝绪悦，白松，姚开，贾冬英*

(1.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065；2.四川大学 泸州产业技术研究院，四川 泸州 646000)

洋葱(AlliumcepaL.)，又名葱头、玉葱、洋蒜等，因其鲜明的挥发性特征风味和极高的营养价值，被誉为“蔬菜皇后”，受到消费者的喜爱[1]。洋葱的特征风味主要源于其含硫化合物，当洋葱经过切分、捣碎等处理后，洋葱细胞液泡中的蒜氨酸酶得以释放，迅速催化风味前体S-烷基-L-半胱氨酸亚砜(ACSOs)发生酶促反应，生成次磺酸、丙酮酸和氨。其中，次磺酸极易自发聚合，形成蒜素类物质硫代亚磺酸酯(thiosulfinate, TS)，随后TS发生降解重排，生成多种挥发性硫化物，从而形成洋葱的特有风味[2]。

盐渍是我国生鲜蔬菜传统的加工方式，既能延长食品贮藏期，也具有增强蔬菜风味、激活果蔬内源酶活性等作用[3]。Cheng等[4]报道了新鲜洋葱、自然发酵洋葱和加盐发酵洋葱的主要挥发性硫化物分别占总挥发物的24%、1.85%和17.51%，指出加盐发酵洋葱的挥发性硫化物损失较小，并且加盐发酵后洋葱中酯类物质含量增加，此发酵方法既保留了洋葱的特有香味，又增添了甜味和果香味，同时减少了洋葱的刺激性气味。因此，在发酵过程中添加食盐有利于洋葱特征风味的保持。然而，目前有关盐渍对新鲜洋葱风味物质的影响及其作用机制却鲜有报道。基于此，本文研究了食盐浓度、盐渍温度和时间对洋葱挥发性风味成分和蒜氨酸酶的影响，并初步分析其作用机制，期望获得的研究结果能为风味浓郁的洋葱制品和其他盐渍蔬菜制品的生产提供理论依据和应用参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

紫皮洋葱和食盐：购于成都某大型超市。

烯丙基甲硫醚(色谱纯)：购于阿拉丁试剂公司；丙酮酸钠、2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)、氢氧化钠、三氯乙酸、L-半胱氨酸、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等：均为国产分析纯试剂。

1.1.2 仪器

DS-1微量捣碎机 常州方科仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪(SH-Rxi-5Sil MS色谱柱) 安捷伦公司；GL-20G-C高速冷冻离心机 上海安亭飞鸽有限公司；UV-6000PC紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 洋葱蒜氨酸酶活性测定

1.2.1.1 丙酮酸标准曲线的绘制[5]

分别将0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL的0.01 mol/L丙酮酸钠标准溶液用蒸馏水稀释至50 mL，混匀后取每种浓度稀释液4 mL放入不同试管中，然后加入5 mmol/L 2,4-DNPH溶液1 mL，混匀后于25 ℃反应5 min，再加入2.5 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，混匀后于25 ℃下反应10 min，于520 nm处测定反应液的吸光度。以丙酮酸含量(x，μg)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线，对其进行线性回归后得到回归方程为：y=37154.26x-0.02211，R2=0.9992。

1.2.1.2 蒜氨酸酶活性测定

参照秦晓春[6]的方法分别提取蒜氨酸粗酶和蒜氨酸。将1 mL粗酶液与1 mL蒜氨酸混匀后于25 ℃反应5 min，立即加入10%(W/V)三氯乙酸2 mL终止反应，然后加入5 mmol/L 2,4-DNPH溶液1 mL，混匀后于25 ℃反应5 min，再加入2.5 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，混匀后于25 ℃下反应10 min，于520 nm处测定反应液的吸光度。蒜氨酸酶酶活的定义为：在25 ℃条件下，每1 min生成1 μg丙酮酸为1个酶活单位U。每种样品平行测定3次。

1.2.2 洋葱中硫代亚磺酸酯(TS)含量测定

参照李瑜等[7]采用紫外分光光度法测定洋葱中TS含量。将洋葱浆液于8000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，加入3 mL适宜浓度的L-半胱氨酸溶液，25 ℃下反应5 min，加入1.5 mmol/L DTNB溶液2 mL，用pH 7.5的磷酸缓冲溶液稀释至25 mL，摇匀，显色4 min，于412 nm处测定反应液的吸光度A1。另外，用1 mL蒸馏水代替样品液，按以上步骤测定A0。每种样品平行测定3次。

式中：A为A0-A1；B为L-半胱氨酸的稀释倍数；162.62为TS的相对分子质量；14150为显色物质在412 nm下的摩尔吸光系数；M为所取样品液质量(g)，2为一分子TS消耗两分子L-半胱氨酸。

1.2.3 食盐浓度的影响

将新紫皮洋葱去皮洗净、切丁后均匀分成5份(每份100 g)，将其中4份分别与其质量的3%、6%、9%、12%的食盐混合，1份不加食盐作为对照，于12 ℃下放置24 h，加入洋葱质量1倍的饮用纯净水后打浆1 min，测定各样品挥发性风味物质、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.4 盐渍温度的影响

将新紫皮洋葱去皮洗净、切丁后均匀分成5份(每份100 g)，与其质量为9%的食盐混合，其中4份于8，12，16，20 ℃盐渍24 h，1份于4 ℃盐渍作为对照，加入洋葱质量1倍的饮用纯净水后打浆1 min，测定各样品挥发性风味物质、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.5 盐渍时间的影响

将新紫皮洋葱去皮洗净、切丁后均匀分成5份(每份100 g)，与其质量为9%的食盐混合，其中4份于20 ℃分别盐渍12，24，36，48 h，1份加盐洋葱直接打浆作为对照(记为0 h盐渍洋葱)，加入洋葱质量1倍的饮用纯净水后打浆1 min，测定各样品挥发性风味物质、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.6 洋葱挥发性成分测定

采用顶空固相微萃取结合GC-MS法测定洋葱挥发性成分[8]。样品前处理：称取5 g洋葱浆液，加入20 μL浓度为0.4015 mg/mL 烯丙基甲硫醚(内标)的甲醇溶液于顶空瓶中，混匀。选取50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，于50 ℃萃取30 min，迅速插入气相色谱仪进样口，于250 ℃解吸5 min后取出。每种样品平行测定2次。

色谱条件：载气为氦气，流速为1 mL/min，不分流模式；升温程序：柱初温35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持3 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。

质谱条件：采用电子轰击离子源，温度为230 ℃，扫描范围35～500 m/z。

检出化合物的质谱图与NIST 14/NIST 14s谱库比对，取相似程度大于80%的化合物作为检测结果，以烯丙基甲硫醚为内标物，半定量挥发性物质的含量。以各挥发性化合物的相对含量表示盐渍对洋葱挥发性物质的影响，相对含量指该化合物含量以各对照样品中的含量为100%换算。

1.3 数据处理

实验结果采用Origin 2017软件绘制图形，采用SPSS 17.0软件对结果进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 食盐浓度对洋葱挥发性物质的影响

食盐浓度对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响见表1。

表1 食盐浓度对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响Table 1 Effect of salt concentration on the variety and content of volatile compounds in onion

与对照(不加盐洋葱)相比，盐渍后洋葱中挥发性硫化物种类及其含量明显增加，醛类和烷烃类物质含量显著降低，酸类物质含量增加。随着食盐浓度增加，洋葱含硫化合物含量先增加后降低，在食盐浓度为9%时达到最高(85.52 mg/kg)，占挥发性化合物总量的93.33%，较未加盐洋葱增加了5.21倍，表明盐渍可显著增强洋葱特有的风味。此外，醛类物质以具有青草味的2-甲基-2-戊烯醛和己醛为主，且前者是催泪物质硫代丙醛-S-氧化物的最终降解产物。在盐渍后该两种醛类物质的含量明显降低，表明盐渍洋葱的青草味减弱，有利于洋葱整体风味更加柔和。

洋葱中挥发性风味物质主要以含硫化合物和醛类物质为主，硫化物与醛类较其他种类挥发性物质具有更低的阈值，因此是洋葱挥发性风味的主要贡献成分[9]。Koutidou等[10]研究结果显示二丙基二硫醚、硫代乙酸丙酯和二丙基三硫醚是洋葱的特征香气成分，赋予了洋葱特有的葱香味。本研究中，盐渍洋葱含有15种关键挥发性风味物质，其中，8种具有洋葱特征葱香味的物质包括硫代乙酸丙酯(S-PrThAc)、烯丙基甲基二硫醚(MeAlDiS)、甲基丙基二硫醚(MePrDiS)、二丙基二硫醚(DiPrDiS)、甲基丙基三硫醚(MePrTrS)、二丙基三硫醚(DiPrTrS)、烯丙基硫醇(AlMec)和丙烯基丙基二硫醚(PePrDiS)；7种具有洋葱刺激性气味的物质有硫代丙醛-S-氧化物(PrthS-O)、3,4-二甲基噻吩(3,4-DiMeTp)、1,3-二噻烷(1,3-Dith)、二甲基三硫醚(DiMeTrS)、二甲基四硫醚(DiMeTeS)、己醛(He)和2-甲基-2-戊烯醛(2-Me-2-Pet)[11-12]。

食盐浓度对洋葱15种关键挥发性风味物质相对含量的影响见图1。

图1 食盐浓度对洋葱关键挥发性风味物质相对含量的影响Fig.1 Effect of salt concentration on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由图1可知，盐渍处理后，8种具有洋葱特征香气的成分含量显著增加，7种刺激性挥发性物质中1,3-Dith、DiMeTrS和He含量明显下降，其余物质的含量变化不明显，表明盐渍处理后洋葱的整体特征气味更加浓郁，洋葱香味突出，刺激性气味有所减弱。随着食盐浓度增加，8种挥发性物质相对含量先增加后降低，食盐浓度为9%时增幅最大，相对含量增幅最大的挥发性物质为DiPrDiS、MePrTrS和DiPrTrS。食盐浓度为12%时，15种关键挥发性物质相对含量均开始降低，S-PrThAc未检出，但其余7种洋葱香味挥发性物质相对含量仍高于对照，表明食盐浓度过高会阻碍盐渍洋葱的挥发性风味物质形成。综上，当食盐浓度为9%时，盐渍洋葱的香味最浓郁。

2.2 盐渍温度对洋葱挥发性物质的影响

盐渍温度对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响见表2。

表2 盐渍温度对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响Table 2 Effect of salting temperatures on the variety and content of volatile compounds in onion

由表2可知，随着盐渍温度升高，洋葱总挥发性物质和挥发性硫化物含量增加，醛类物质含量先增加后降低，酸类物质含量明显增加，但温度并未影响盐渍洋葱中挥发性物质种类变化。当盐渍温度为20 ℃时，洋葱挥发性硫化物含量达到最高(166.33 mg/kg)，占挥发性化合物总量的97.20%，比4 ℃盐渍洋葱增加了1.51倍，表明较高的盐渍温度更有利于洋葱特征风味的形成，且不会影响盐渍洋葱的整体风味。温度为20 ℃时，洋葱整体挥发性风味最强。

盐渍温度对洋葱15种关键挥发性风味物质相对含量的影响见图2。

图2 盐渍温度对洋葱关键挥发性风味物质相对含量的影响Fig.2 Effect of salting temperatures on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由图2可知，盐渍温度对8种洋葱特征香味物质含量的影响不尽相同。随着温度升高，DiPrDiS、DiPrTrS、MePrDiS和MePrTrS的相对含量增加，于20 ℃时达到最大值；S-PrThAc、MeAlDiS、AlMec和PePrDiS的相对含量先增加后降低，这可能是因为这类挥发性物质的化学结构不稳定，温度升高会加速其降解，导致其含量降低。随着温度升高，5种刺激性挥发性成分的相对含量均降低，而Prth-S-O和2-Me-2-Pet受温度影响显著，其含量随着温度升高呈先增高后降低的趋势，8 ℃时达到最大值。这可能是因为温度升高不仅激活催泪因子酶的活性，同时加快Prth-S-O的降解和挥发，从而在较低温度下催泪成分累积，20 ℃时催泪成分的生成速率小于其挥发和降解速率[13]。因此，从整体上看，20 ℃盐渍更有利于洋葱香味的形成与释放，可明显减弱其刺激性气味。

2.3 盐渍时间对洋葱挥发性风味物质的影响

盐渍时间对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响见表3。

表3 盐渍时间对洋葱挥发性物质种类及其含量的影响Table 3 Effect of salting time on the variety and content of volatile compounds in onion

续 表

由表3可知，洋葱总挥发性物质和挥发性硫化物含量随盐渍时间增加呈先增大后减小的趋势，醛类种类显著增加但其总量降低，酸类物质含量先增加后降低。当盐渍时间为24 h时，洋葱挥发性硫化物总量达到最大值(104.41 mg/kg)，占挥发性化合物总量的97.69%，是对照(0 h盐渍洋葱)的5.22倍。在盐渍时间超过24 h后醇类和醛类物质种类增加，这可能与耐盐微生物繁殖有关。

盐渍时间对洋葱15种关键挥发性风味物质相对含量的影响见图3。

图3 盐渍时间对洋葱关键挥发性风味物质相对含量的影响Fig.3 Effect of salting time on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由图3可知，随着盐渍时间延长，10种挥发性物质相对含量先增加后减少，另外5种挥发性物质相对含量明显降低，表明盐渍时间可明显影响盐渍洋葱的挥发性风味。在盐渍前期(盐渍时间≤24 h)，除MeAlDiS外，7种洋葱香味物质和3种刺激性物质相对含量显著增加，但具有洋葱香味的挥发性物质增幅更大，其中盐渍24 h时，DiPrTrS的相对含量增幅最大，此时洋葱香味较对照更加突出；此后随着盐渍时间延长，15种关键挥发性风味物质相对含量均显著降低，48 h时盐渍洋葱中11种挥发性风味物质的相对含量低于对照洋葱，洋葱的特征风味明显减弱，这可能是挥发性物质的挥发和风味酶的活性降低有关。此外，在盐渍36 h和48 h的洋葱中检测出反-2,4-癸二烯醛和顺-4-庚烯醛等具有哈喇味和油脂味的成分，表明盐渍时间过长会产生异味物质。因此，盐渍24 h时洋葱的挥发性风味最佳。

2.4 盐渍对洋葱挥发性风味影响的作用机制

食盐浓度、盐渍温度和盐渍时间对蒜氨酸酶酶活力的影响见图4中A，B，C。可以看出，随着食盐浓度的增大，洋葱蒜氨酸酶活性呈先增强后减弱的趋势，当食盐浓度为9%时，其活力最大，与未加盐洋葱相比，其酶活升高了161.12%。随着盐渍温度提高，洋葱蒜氨酸酶活性显著提高，于20 ℃达最大值，与4 ℃盐渍洋葱相比，其酶活升高了152.20%。随着盐渍时间延长，洋葱蒜氨酸酶活性先升高后降低，于24 h达最大值，与0 h盐渍洋葱相比，其酶活升高了125.97%。此结果与上述盐渍对洋葱挥发性物质含量的变化趋势一致，表明盐渍处理可改变洋葱蒜氨酸酶活力，从而影响其挥发性风味的形成。金属离子通过影响蒜氨酸酶辅助因子5′-磷酸吡哆醛的结构及与蒜氨酸酶主链的结合激活蒜氨酸酶。郭娟等[14]发现，Na+能显著增强洋葱蒜氨酸酶活性。在盐渍初期，洋葱细胞被破坏，蒜氨酸酶释放，与丰富的底物和辅酶因子结合，并在Na+的激活下催化产生大量风味物质。但随着时间延长，底物浓度和辅酶因子浓度降低，已释放的蒜氨酸酶长时间处在高盐浓度环境下会逐渐降解，导致其活力下降。因此，过高的盐浓度和过长的盐渍时间均不利于洋葱蒜氨酸酶活力的保持。

图4 盐渍对蒜氨酸酶酶活及TS和总挥发性硫化物的影响Fig.4 Effect of salting on alliinase activity, TS and total volatile sulfides

食盐浓度、盐渍温度和盐渍时间对TS和总挥发性硫化物含量的影响见图4中D，E，F。可以看出，各盐渍条件对TS与总挥发性硫化物含量的影响与对蒜氨酸酶活的影响一致，食盐浓度为9%、盐渍温度为20 ℃、盐渍时间为24 h时分别达到最大值。并且各盐渍条件下TS和挥发性硫化物含量有较好的线性拟合，说明TS可作为洋葱特征挥发性风味强度的辅助指标，这与刘艳灿[15]关于红葱头中TS含量与其感官风味相关的研究结果一致。由图4中D，F可知，不同食盐浓度和盐渍时间下，TS和总挥发性硫化物的拟合趋势较好，表明食盐浓度和盐渍时间并未改变TS降解速率，其挥发性风味物质含量仅与TS有关。由图4中E可知，在较低温度时，TS与总挥发性硫化物含量拟合较好，随着温度升高，挥发性风味物质含量增加低于TS增加。这可能是较高温度时产生的风味物质挥发损耗更大，从而使TS检测值增加高于总挥发性硫化物增加。

综上所述，盐渍主要通过激活洋葱中的蒜氨酸酶提高了其TS和挥发性硫化物含量，从而明显增强洋葱的特征风味。

3 结论

盐渍处理后洋葱的挥发性风味物质含量发生显著变化，其含量随食盐浓度增大和盐渍时间的延长先增加后减少，随盐渍温度升高而明显增加。当食盐浓度为9%、盐渍温度为20 ℃、盐渍时间为24 h时，洋葱的总挥发性风味成分含量和总挥发性硫化物含量最高，其特征风味更加浓郁，同时刺激性气味减弱。盐渍通过提高蒜氨酸酶的活性，促进洋葱中TS和挥发性硫化物的生成，从而增强了洋葱的特征风味。