结核分枝杆菌对miR-21和TLR-4/NF-κB信号通路的影响研究*

麦 叶，林瑶瑶，刘海林，钟有清

(1.海南省中医院重症医学科，海口 570203；2.海南医学院第一附属医院呼吸内科，海口 570102)

肺结核是1种主要由结核分枝杆菌(Mtb)感染引起的慢性消耗性传染病，在经济欠发达国家和地区，其近年来发病率不断升高，严重威胁人类健康[1]。巨噬细胞可吞噬入侵的Mtb，并呈递抗原，使机体获得特异的抗结核免疫力，但Mtb是典型的细胞内寄生菌，可通过多种机制逃避巨噬细胞的抗微生物作用，在巨噬细胞等宿主免疫细胞内存活和繁殖。研究显示，机体的免疫应答反应抑制Mtb生长，其中90%的病原体潜伏在感染病灶中，进入休眠状态。一旦免疫系统出现异常，休眠状态的Mtb即进入复苏状态，肺结核复发[2]。在肺结核致病及复发过程中，Mtb与巨噬细胞的相互影响发挥重要作用[3]。因此，研究其作用机制对于探讨肺结核的临床治疗具有重要意义。Toll样受体(TLR)是人呼吸道天然免疫中的关键受体，TLR4广泛表达于气道上皮，在呼吸道黏膜免疫中有重要作用，可能参与肺结核发生、发展[4]。有研究报道，微小RNA(miRNA/miR)可调节TLR信号通路[5]。本研究将Mtb感染RAW264.7和THP-1细胞后，对miR-21表达和TLR-4/核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响进行分析，旨在研究Mtb与巨噬细胞的相互作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株与细胞株

RAW264.7和THP-1细胞购自中科院上海细胞库；强毒Mtb H37Rv及弱毒Mtb BCG(牛型结核杆菌减毒株，卡介苗)购自北京生物制品研究所。

1.1.2主要试剂与材料

DMEM培养基、1640培养液、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自美国R&D公司；流式细胞仪、异硫氰酸荧光素(FITC)-膜联蛋白V(Annexin V)-碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物公司；本研究所使用ELISA试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司；miR-21与内参基因U6基因及TLR4、NF-κB和内参基因β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞及Mtb培养

RAW264.7细胞：复苏后常规培养于含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基内(5% CO2，37 ℃饱和湿度)，置于细胞培养箱培养，0.1%胰蛋白酶消化悬浮，铺于12孔板中继续培养(5×105个/mL)。THP-1细胞:复苏后常规培养于含有10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640培养液内(5% CO2，37 ℃饱和湿度)，置于细胞培养箱培养，调整浓度为5×105个/mL，利用佛波醇酯类多克隆刺激(PMA)诱导24 h，待细胞分化贴壁后，在12孔板中继续培养。Mtb：将罗氏培养基上的H37Rv菌落分别刮下，接种于7H9液体培养基培养5 d，液体可见明显浑浊，且有白色颗粒，菌膜挂壁；BCG菌株接种于7H9液体培养基培养7 d，可见液体稍许浑浊，且有黄色颗粒，菌膜挂壁。

1.2.2Mtb感染RAW264.7细胞和THP-1细胞模型建立

细胞浓度为5×105个/mL，Mtb浓度5×106个/mL，使Mtb感染12孔板中贴壁良好的细胞，5% CO2，37 ℃细胞培养箱中孵育4 h(培养基中无血清和双抗)，继续培养48 h。实验分组：RAW264.7细胞分为对照组、H37Rv感染组和BCG感染组；THP-1细胞分为对照组、H37Rv感染组和BCG感染组。

1.2.3细胞凋亡检测

胰蛋白酶消化感染后细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，洗涤后，利用平板计数，使细胞数为1×105个/mL，加入Annexin V-FITC及PI溶液，避光孵育(25 ℃，15 min)，加入Buffer，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.4qRT-PCR检测miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表达

利用Trizol法提取总RNA，检测合格后，利用逆转录试剂盒逆转录，获得cDNA,利用qRT-PCR试剂盒检测miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表达。反应体系为20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，循环结束后升温至95 ℃ 15 s，降至60 ℃ 15 s，95 ℃ 20 min。每个标本均重复检测3次，结果取平均值，相对表达水平根据2-ΔΔCT法计算，见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5细胞因子检测

利用ELISA法检测感染12 h后[6]细胞上清液中白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 RAW264.7和THP-1细胞形态变化

RAW264.7正常细胞折光度好，边缘清晰，感染后细胞发生皱缩，细胞质内有小泡，边界不清晰；正常THP-1细胞大小均一，细胞透亮，形态规则，包膜完整，PMA诱导后贴壁生长，部分细胞伸出伪足，见图1。

A：正常RAW264.7细胞；B：Mtb感染后RAW264.7细胞；C：正常THP-1细胞；D：PMA诱导后THP-1细胞。

2.2 细胞凋亡检测结果

在THP-1细胞中，H37Rv感染组及BCG感染组细胞凋亡率较对照组明显升高，且BCG感染组细胞凋亡率较H37Rv感染组明显升高(P<0.05)。在RAW264.7细胞中，H37Rv感染组及BCG感染组细胞凋亡率较对照组明显升高，且BCG感染组细胞凋亡率较H37Rv感染组明显降低(P<0.05)，见图2。

A：RAW264.7细胞对照组；B：RAW264.7细胞BCG感染组；C：RAW264.7细胞H37Rv感染组；D：THP-1细胞对照组；E：THP-1细胞BCG感染组；F：THP-1细胞H37Rv感染组；G：细胞凋亡比例；a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与H37RV感染组比较。

2.3 miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表达情况

与RAW264.7细胞对照组比较，BCG感染组及H37Rv感染组miR-21低表达，TLR4、NF-κB mRNA高表达(P<0.05)，且BCG感染组TLR4、NF-κB mRNA较H37RV感染组表达水平更高(P<0.05)。与THP-1细胞对照组比较，BCG感染组及H37Rv感染组miR-21低表达，TLR4、NF-κB mRNA高表达(P<0.05)，且BCG感染组TLR4、NF-κB mRNA较H37Rv感染组表达水平更高(P<0.05)，见图3。

A：RAW264.7细胞mRNA表达情况；B：THP-1细胞mRNA表达情况；a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与H37Rv感染组比较。

2.4 细胞因子检测结果

与RAW264.7细胞对照组比较，BCG感染组及H37Rv感染组TNF-α、IL-6、IL-10表达水平均明显升高(P<0.05)，且BCG感染组TNF-α、IL-6表达水平较H37Rv感染组明显降低，IL-10明显升高(P<0.05)。与THP-1细胞对照组比较，BCG感染组及H37Rv感染组TNF-α、IL-6、IL-10表达水平明显升高(P<0.05)，且BCG感染组TNF-α、IL-6表达水平较H37RV感染组明显升高，IL-10明显降低(P<0.05)，见图4。

A：细胞TNF-α表达水平；B：细胞IL-6表达水平；图C：细胞IL-10表达水平；*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与H37Rv感染组比较。

3 讨 论

作为一种人畜共患的消耗性疾病，肺结核严重危害我国民众的生命健康。近年来，由于部分耐药Mtb的出现，结核病的防治工作面临新的威胁。目前，多项研究结果显示，巨噬细胞是宿主控制Mtb感染散播的主要防御屏障，可吞噬Mtb，进行消化清除[7-8]。另外，巨噬细胞在Mtb免疫逃逸中也发挥重要作用，导致结核病的慢性症状，使其具有潜伏性和传染性。静息状态的巨噬细胞被抗原刺激活化，产生多种细胞因子继续刺激、活化巨噬细胞，吞噬Mtb，诱导巨噬细胞坏死，引起巨噬细胞崩解，将Mtb释放，重新被其他巨噬细胞吞噬，使Mtb得以在细胞间传播。感染后的巨噬细胞发生凋亡，分解为有囊膜包裹的吞噬小体，吞噬小体可降低Mtb活性，促进机体先天性免疫反应。RAW264.7细胞及可经PMA诱导分化为巨噬细胞的THP-1细胞已被广泛应用于Mtb与巨噬细胞相互作用的研究中[9]。本研究通过构建Mtb感染巨噬细胞模型，检测发现，与对照组比较，RAW264.7、THP-1细胞H37Rv感染组及BCG感染组凋亡率均明显升高，与H37Rv感染组比较，THP-1细胞BCG感染组凋亡率明显升高，RAW264.7细胞明显降低，提示Mtb感染巨噬细胞可诱导其凋亡，与吕翎娜等[9]研究结果一致。

有研究显示，TLRs信号在机体适应性免疫应答及固有性免疫应答中具有重要作用，与多种疾病发生、发展关系密切[10]。TLR4主要表达于巨噬细胞，可识别病原相关分子，通过胞内信号传递，诱导免疫炎性因子，扩大非特异性防御作用。TLR4介导的信号转导通路包括MyD88依赖性和非依赖型两条，TLR4活化后，可与MyD88羧基端TLR受体结构域结合，通过一系列磷酸化反应，活化NF-κB诱导激酶(NIK)，NIK可使NF-κB抑制蛋白泛素化降解，从而激活NF-κB，活化后的NF-κB由细胞质进入细胞核内，启动细胞因子的转录、翻译，最终促进TNF-α、IL-6、IL-10的分泌。有研究显示，细菌脂多糖可活化单核巨噬细胞表面TLR4，继而激活NF-κB，诱导炎性因子IL-6、TNF-α释放，参与固有免疫应答[11]。Mtb细胞壁含有大量的分枝菌酸、脂类和多糖，可通过识别、激活巨噬细胞表面的多种受体，如TLR4等，启动相应的免疫防御反应。大量研究表明，miR-21在呼吸道相关疾病中异常表达[12-13]。生物信息学显示，miR-21可能通过靶向调节TLR-4参与机体免疫反应。许瑞等[14]研究报道，高表达miR-21可增加下调TLR4基因的活化能力，引起通路下游NF-κB及IL-6活性降低。同时，也有研究证明，IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子可通过细胞外正反馈调节，进一步导致NF-κB活化[15]。本研究结果显示，感染后RAW264.7及THP-1细胞miR-21低表达，TLR4、NF-κB mRNA高表达，且BCG感染组较H37Rv感染组miR-21低表达，TLR4、NF-κB mRNA高表达，提示Mtb感染可能抑制巨噬细胞内miR-21表达，进而促进TLR4、NF-κB mRNA表达。进一步检测发现，感染12 h后的RAW264.7及THP-1细胞TNF-α、IL-6、IL-10表达水平均明显升高；在RAW264.7细胞中，BCG感染组较H37Rv组TNF-α、IL-6表达水平明显降低，IL-10明显升高；在THP-1细胞中，BCG感染组较H37Rv组TNF-α表达水平明显升高，IL-6、IL-10表达水平明显降低，提示Mtb感染可能影响巨噬细胞的细胞因子分泌。

综上所述，Mtb感染促进巨噬细胞凋亡，抑制机体miR-21表达，从而激活TLR-4/NF-κB信号通路。本研究选择不同毒性的Mtb感染两种巨噬细胞，结果表明，两种Mtb对信号通路及细胞的因子的影响有一定差异，具体原因及机制将在后续研究中展示。