肾衰Ⅱ号方对肾功能衰竭大鼠肠通透性及微炎症的影响

姚东升，徐琳，2，兰天鹰，叶朝阳，2，王琛，2，吴锋

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；2.上海中医药大学中医肾病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203

近年来，慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发病率呈上升趋势，已成为影响人类健康的主要疾病[1]。持续微炎症状态为CKD 疾病进程中的重要组成部分，并与肾功能下降程度密切相关。近年研究表明，肠道屏障功能下降，通透性增高，导致肠道细菌及内毒素移位入血是造成CKD 炎症状态的原因之一[2-3]。上海中医药大学附属曙光医院肾病科长期应用肾衰Ⅱ号方治疗CKD，临床疗效显著[4]。本课题组前期基础研究显示，该方可通过改善大鼠肾脏血氧供应环境、减少肾脏细胞凋亡及自噬、降低炎症因子、抗氧化应激等药理作用而减轻肾损伤[5-7]。临床观察显示，该方改善CKD 3～4 期患者肾功能、延缓肾衰竭进展的作用机制可能与其减少炎症因子、调节微炎症状态有关[8]，同时还观察到食少纳呆、大便不实等症状的改善。提示肠道可能是该方防治CKD、减轻肾毒素的重要药理靶位。本研究观察肾衰Ⅱ号方对肾功能衰竭大鼠肠通透性及微炎症的影响，旨在从肠道通透性角度探讨肾衰Ⅱ号方改善5/6 肾切除大鼠微炎症状态的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SD 大鼠50 只，SPF 级，体质量130～150 g，动物许可证号SCKC（沪）2018-0016，上海必凯实验动物有限公司提供。饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF 级动物房。

1.2 药物

肾衰Ⅱ号方（党参、丹参、川芎、桃仁、紫苏叶、淫羊藿、制大黄各15 g），饮片购自上海市药材公司。上海中医药大学附属曙光医院中药制剂室制备，水提浓缩至含原药材7.58 g/mL。双歧三联活菌1 g，上海信宜制药公司，批号20180521，加蒸馏水制备成50 mg/mL混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）测定试剂盒（南京建成生物制品研究所），内毒素检测试剂盒（美国ACC公司，货号21080309C/BU0209），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）-2、IL-6 和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA 检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），兔抗大鼠Anti-Occludin antibody（英国 Abcam 公司，货号ab216327），Anti-Claudin-1 antibody（英国Abcam 公司，货号ab15098），HRP 标记山羊抗兔IgG（中国Beyotime 公司，批号A0208），HRP 标记IgG（H+L）（中国Beyotime 公司，批号A0216）。M5 酶标仪（赛默飞），Leica DMIL 倒置相差显微镜（德国徕卡）。

2 实验方法

2.1 造模

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，备皮后，脊柱向左旁开1 cm，左侧肋弓下0.5 cm 处做一垂直于脊柱的切口（长约2.5 cm）。无菌条件下经腹膜后钝性游离肾包膜，暴露左肾，分支结扎左肾动脉2/3，关腹缝合。7 d 后摘除右肾。

2.2 分组与给药

28 d 后，采用断尾采血方式测定肾功能指标。剔除造模失败和死亡大鼠，分别测量存活大鼠体质量，并以其作为变量，随机分为模型组、肾衰Ⅱ号方组和阳性对照组，每组10 只。另取10 只大鼠为假手术组。按成人标准体质量（60 kg）常规用量20 倍给药，药物灌胃剂量参照本课题组既往研究[5]，给药体积2 mL，每日1 次，连续60 d。假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃。

2.3 标本留取

实验大鼠禁食5 h 后灌服内毒素，每10 min 灌服1 只，剂量10 mg/kg，3.5 h 后取材，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，下腔静脉取血，取大鼠部分肾脏、10%福尔马林固定小肠，余肾脏及部分肠道组织-70 ℃低温保存。

2.4 肌酐、尿素氮检测

全血常规离心后取上清液，测试盒分析仪检测Cr、BUN 含量。

2.5 内毒素检测

鳌试剂法检测下腔静脉血浆内毒素含量，判定肠通透性变化，严格按试剂盒说明书进行操作。

2.6 炎症因子检测

ELISA 检测血清CRP、TNF-α、IL-2、IL-6、MCP-1含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

2.7 病理观察

常规固定、石蜡包埋、切片、HE 染色，镜下观察肾小球、肾小管、肾间质、肾血管、肠道绒毛、隐窝腺体。

2.8 Claudin-1、Occludin 蛋白表达检测

免疫组化检测肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin 的表达。常规切片，脱蜡乙醇水化，热修复后加入一抗4 ℃湿盒孵育过夜。37 ℃复温1 h，加入二抗，显色，脱水，透明，封片。用PBS 作阴性对照。镜下拍照，用Image-Pro Plus6.0 软件对照分析，阳性表达以测得的平均光密度（IOD）表示。

2.9 Claudin-1、Occludin 基因表达检测

RT-PCR 检测肠道紧密连接蛋白 Claudin-1、Occludin 的mRNA 表达。引物序列见表1。提取总RNA 样本，稀释成相同浓度，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，以特异性引物反转录合成cDNA。程序：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s，以cDNA 为模板扩增基因片段，见表1。反应条件：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，结果以Ct值表示，用2-ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量。

表1 各基因PCR 引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 一般情况

假手术组大鼠一般状态良好，反应灵活，皮毛光滑，精力充沛；模型组大鼠精神萎靡，皮毛少荣，运动、觅食较少，体质量增加迟缓；肾衰Ⅱ号方组、阳性对照组大鼠精神较前好转，食欲尚可，无活动受限，体质量增加明显。给药第6 周肾衰Ⅱ号方组1 只大鼠因灌胃不当意外死亡。

4.2 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠血清肌酐、尿素氮水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清Cr、BUN 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，肾衰Ⅱ号方组血清Cr、BUN 含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较，肾衰Ⅱ号方组血清BUN 含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清Cr、BUN 含量比较（）

表2 各组大鼠血清Cr、BUN 含量比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阳性对照组比较，△P＜0.05

4.3 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠血浆内毒素水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血浆内毒素含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，肾衰Ⅱ号方组大鼠血浆内毒素含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血浆内毒素含量比较（）

表3 各组大鼠血浆内毒素含量比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

4.4 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠血清炎症因子水平的影响

与假手术组比较，模型组血清炎症因子含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，肾衰Ⅱ号方组血清炎症因子含量降低，除MCP-1 外差异均统计学意义（P＜0.05）。见表4。

4.5 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠肾组织病理形态的影响

假手术组大鼠肾脏病理基本正常；模型组肾单位结构杂乱，弥漫性硬化，肾小球可见球囊黏连，周围可见纤维化；肾衰Ⅱ号方组和阳性对照组肾小球结构较模型组完整清晰，囊腔结构较模型组更完整，未见明显粘连，肾小球纤维化有所减轻。见图1。

4.6 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠肠组织病理形态的影响

模型组较假手术组小肠绒毛变短变宽、局部隐窝拉长；肾衰Ⅱ号方组、阳性对照组与假手术组接近。见图2。

表4 各组大鼠血清炎症因子水平比较（）

表4 各组大鼠血清炎症因子水平比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

图1 各组大鼠肾组织形态（HE 染色，×400）

图2 各组大鼠肠组织形态（HE 染色，×100）

4.7 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠肠组织 Claudin-1、Occudin 蛋白和基因表达的影响

免疫组化染色显示，着色为棕黄至棕褐色，肠黏膜上皮细胞边缘广泛连续性着色，可见点状或蜂窝状聚集，模型组着色散乱不连续，明显减少，各给药组明显好转，见图3、图4。与假手术组比较，模型组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin 蛋白和mRNA 表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，肾衰Ⅱ号方组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin 蛋白表达明显升高（P＜0.05），mRNA 表达变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、表6。

图3 各组大鼠肠组织Claudin-1 蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

图4 各组大鼠肠组织Occludin 蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

表5 各组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin 蛋白表达比较（，IOD 值）

表5 各组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin 蛋白表达比较（，IOD 值）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

表6 各组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin mRNA 表达比较（）

表6 各组大鼠肠组织Claudin-1、Occludin mRNA 表达比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05

5 讨论

临床上微炎症状态常常无明显症状，是在免疫复合物、微生物、内毒素、补体等刺激下，机体产生以单核巨噬细胞系统激活，IL-2、IL-6、TNF-α 促炎因子释放为主的全身性慢性炎症状态[9]。由肾小球系膜细胞（MC）分泌产生的IL-6、IL-2、TNF-α 等细胞因子，可与MC 上相应受体结合，刺激MC 增殖[8]。超量的IL-6、IL-2和TNF-α导致肾小球系膜细胞增殖、肾小球硬化、肾小管间质细胞增殖和细胞外基质沉积，造成原发疾病进展。IL-2 通过激活及趋化嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和T 细胞加剧急性炎症反应。

炎症是CKD 恶化的主要原因之一，但导致CKD炎症反应的起源位点目前尚无定论。近年研究表明，肠道通透性增加，导致肠道细菌及内毒素移位入血为造成CKD 炎症状态的原因之一[10-12]。肠道虽然为体内消化器官，但却是一个体内延伸的外部环境，因为肠道内包含人体最大的微生物群。肠道除消化食物、排泄废物外，同时也可防止微生物及其有害产物进入内环境。内毒素是寄居在肠道的革兰阴性细菌细胞壁分解出来的脂多糖，具有很高的免疫原性。当肠道屏障功能下降，肠道毒素尤其内毒素入血，使黏附分子、趋化因子和细胞因子大量产生，造成全身系统性炎症反应[13-14]。血清内毒素含量可一定程度上反映肠道屏障功能变化。研究表明，益生菌的使用可改善CKD患者的免疫炎症及氧化应激[15]。

肠道屏障功能的主要结构基础为肠上皮细胞间的紧密连接、黏附连接等。其中紧密连接为最重要的连接方式，对维护上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性发挥着最主要的作用[16]。紧密连接是由超过50 种蛋白质组成的复合体，通过吻合点封闭细胞间隙。Occludin 及Claudins 是参与肠壁通透性的、调节紧密连接的主要结构蛋白之一[17-19]。紧密连接蛋白的减少或破坏将使肠道通透性增高，使大分子物质（内毒素、病原体等）从肠腔进入血液。

中医藏象学说认为，五脏六腑相互关联、互根互用。大便难解或大便溏泄等“肠”分清泌浊失律，传导下注失司皆为“肾”病所累。《诸病源候论·大便病诸候》有“邪在肾，亦令大便难。所以尔者，肾脏受邪，虚则不能制小便，则小便利，津液枯燥，肠胃干涩，故大便难，又渴利之家，大便亦难，所以尔者，为津液枯竭，致令肠胃干燥”。肾衰Ⅱ号方寒热并用，补泻兼施，益气活血，降浊解毒，标本兼顾。方中党参补益脾气，健脾止泻；制大黄具有荡涤肠道之功，通因通用，用于腑实泄泻；黄连清热燥湿，为治疗湿热下注及疫毒所致泄泻要药。在治疗肾病同时，肾衰Ⅱ号方也为治疗泄泻常用药物，提示肠道很可能是该方防治CKD、减轻肾毒素的重要药理靶位。

实验研究表明，5/6 肾切除大鼠模型存在肠道功能障碍、肠道通透性增加[3，20]。本实验选用5/6 肾切除大鼠模型，参考肠通透性评价方式[21]，处死前予内毒素灌胃，取材后测定血浆内毒素含量以判断肠道屏障功能。结果显示，模型大鼠炎症因子及内毒素含量显著升高，表明该模型存在肠道屏障受损、微炎症状态加剧。同时，紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin 表达下降，提示紧密连接破坏是该模型肠道机械屏障功能改变的主要原因。本实验研究显示，养血活血、降浊化瘀为功效的肾衰Ⅱ号方可改善模型大鼠肾功能，同时降低血清炎症因子和内毒素的含量，表明改善肠道屏障功能抑制肠源内毒素入血降低微炎症水平是该方有效治疗肾功能衰竭的靶点之一。进一步检测提示，该方可上调肠组织Claudin-1、Occludin 蛋白表达，提示缓解肠上皮细胞紧密连接破坏是该方修复肠道机械屏障功能的主要机制。

综上，肾衰Ⅱ号方降低5/6 肾功能衰竭大鼠微炎症的作用可能是通过改善肠道通透性而达到的。这为该方临证运用与新复方开发佐以科学依据的同时，也为从“肾-肠”角度开展中医药防治慢性肾功能衰竭的研究提供可参考的路径与方法。