油桃酸腐病病菌的分离鉴定及其生物学特性

苟攀宁，薛应钰，陈军宏，张欣，张扬

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070)

油桃(Prunuspersicavar.nectarina)是普通桃的变种，因其果面光滑无毛而得名[1].它原产于中国西北地区，目前，亚洲和北美洲的一些国家已经发展为油桃生产大国[2].中国是全球最大的油桃生产国，油桃不仅成为我国设施栽培的主要类型，在露地生产中的发展也相当迅速，主要分在山东、北京、河北、河南、陕西、山西和甘肃等地[3].2017年中国油桃的栽培面积占桃栽培总面积的20%以上[4]，2021年油桃产量已超过1 200万 t[5]，已经成为主栽区主要的水果支柱产业.油桃因其皮光无毛、色鲜味美、营养丰富、食用方便而深受消费者的青睐[6].但是，随着油桃种植面积的扩大，树势的衰老以及栽培管理措施不当，病害逐年加重，严重影响了油桃的产量和品质，给果农造成了极大的经济损失.目前国内报道的油桃病害多为集中在生长期的一些病害，如由树生黄单胞李致病变种(Xanthomonasarboricolapv.pruni)、嗜果刀孢菌(Clasterosporiumcarpophilum)、核果假尾孢菌(Pseudocercosporacircumscissa)引起的穿孔病[7-8]；由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的流胶病[9]；由嗜果黑星菌(Venturiacarpophila)引起的疮痂病[10]；灰葡萄孢(Botrytiscinerea)危害油桃花、叶片和果实引起的灰霉病[11]；畸形外囊菌(Taphrinadeformans)引起的缩叶病[12]；褐腐病菌(Moniliafructigena)引起油桃褐腐病使果实脱落腐烂等[13].油桃由于皮薄肉软，组织含水量高，在采后运输和贮藏过程中易受到微生物侵染发生腐烂，酸腐病就是一种比较典型的难防治的果蔬采后病害[14].该病自2001年首次在美国图拉雷县报道以来[15]，近年来发病率呈明显上升趋势，据报道，2012年油桃酸腐病在美国加州的发病率为3.4%～26.1%[16].但是，国内未见油桃酸腐病的系统报道.甘肃省临夏县从2000年开始油桃引种、试验和示范，截至目前，油桃栽培面积达到107 hm2，初果面积57 hm2，产值达23万元/hm2以上[17].油桃产业已成为当地群众增收致富的主要产业.2019年在甘肃省临夏市临夏县油桃成熟采摘期间，在5个果园均发现油桃酸腐病，引起果实腐烂且伴有浓烈酸臭味，造成油桃品质和商品率降低，严重影响当地油桃产业的经济效益.笔者以油桃酸腐病病果为材料，对其病原菌进行分离鉴定和生物学特性研究，以期进一步确定油桃酸腐病的病原菌，间接明确油桃安全贮藏和影响病害发生的关键因子，为油桃采后病害防控及保鲜提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试油桃酸腐病病果和健康油桃均采自甘肃省临夏市南塬乡张河西村.

供试培养基：葡萄糖马铃薯琼脂培养基(PDA)：葡萄糖20 g、马铃薯200 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL；蔗糖马铃薯琼脂培养基(PSA)：蔗糖20 g、马铃薯200 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL；合成低营养琼脂培养基(SNA)：葡萄糖0.5 g、蔗糖0.2 g、KNO31.0 g、KH2PO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4· 7H2O 0.5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL；察氏培养基：蔗糖30 g、NaNO32.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g 、FeSO40.01 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL；孟加拉红琼脂培养基；马丁氏培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL；碳源基础培养基：酵母粉20 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、KH2PO42.0 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL；氮源基础培养基：葡萄糖20 g、KH2PO42.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL.

1.2 试验方法

1.2.1 病原物的分离与纯化 病原物的分离参照组织分离法[18]，先用蒸馏水将发病油桃的表面冲洗干净，然后在超净工作台中用75%的乙醇在病果表面冲洗30 s进行表面消毒，接着用无菌水持续冲洗60 s.等晾干以后在病健交界处取边长为5 mm的正方形组织块，将其置于PDA培养基中，每皿4个组织块.放在25 ℃的培养箱中黑暗培养5 d后挑取菌落边缘部分再次进行分离，最后经过单孢纯化获得致病菌株，将分离纯化好的菌株接种在PDA培养基上置于4 ℃冰箱内保存.

1.2.2 致病性测定 将分离获得的菌株接种在PDA培养基上培养5 d以后，先用0.02% 吐温-80溶液洗脱分生孢子并在磁力搅拌器上搅拌15 min，充分混合均匀；接着用双层医用纱布过滤获得分生孢子悬浮液，最后利用血球计数板统计分生孢子数，加入无菌水制成1×106个/mL的孢子悬浮液.取成熟度一致的健康油桃，用75%酒精进行表面消毒.分别采用针刺[19]和无伤处理方式，喷雾接种油桃，每处理设5个重复，以无菌水为对照.接种处理完后将其放置在底部铺有双层湿润滤纸的烧杯中，用保鲜膜封口进行保湿培养(25 ℃)，每隔24 h观察其发病症状并记录.待其发病后进行病原菌的再分离，与初分离获得的菌株性状进行比较.

1.2.3 菌株鉴定 形态学鉴定，将经过柯赫氏法则验证后的菌株打成菌饼(5 mm)接种到PDA培养基的中央，置于25 ℃条件下恒温培养，待菌落面积达到培养皿面积约2/3时，观察记录菌落的颜色、形状和气味等特征，并在光学显微镜下观察产孢结构以及孢子形态，参照《真菌鉴定手册》[18]对病原菌进行鉴定.

分子学鉴定，将供试菌株在PDA培养基中培养5 d以后收集菌丝体，然后用CTAB法提取DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)以及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增其ITS序列，委托西安擎科生物有限公司对其序列进行测序.最后将获得的测序结果在NCBI上进行 BLAST比对分析，并提交序列获取GenBank登录号.利用 MEGA 7.0 软件以邻接法(neighbor-joining，NJ)，构建系统发育树[20].

1.2.4 病原菌生物学特性测定

1.2.4.1 温度对菌丝生长以及产孢量的影响 将直径为5 mm的菌饼接种于PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的黑暗培养箱中培养，每个处理重复5次，7 d后用十字交叉法测量其菌落直径以及产孢量.

1.2.4.2 光照对菌丝生长以及产孢量的影响 将直径为5 mm的菌饼接种于PDA平板上，设置连续黑暗、连续光照、12 h光照黑暗交替3种不同光照条件，于25 ℃下恒温培养.其他同1.2.4.1.

1.2.4.3 不同种类培养基对菌丝生长以及产孢量的影响 以PDA培养基、PSA培养基、合成低营养琼脂培养基、查氏培养基、孟加氏培养基和马丁氏培养基为供试培养基，将直径为5 mm的菌饼接种于供试培养基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.4 碳源对菌丝生长以及产孢量的影响 以改良马丁氏培养基为基础培养基，分别加入葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、可溶性淀粉等配制不同碳源的供试培养基，将直径为 5 mm的菌饼接种在供试培养基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.5 氮源对菌丝生长以及产孢量的影响 以改良马丁氏培养基为基础培养基，分别加入尿素、KNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏等配制不同氮源的供试培养基将直径为5 mm的菌饼接种在供试培养基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.6 pH对菌丝生长以及产孢量的影响 用无菌的1 mol/L的NaOH和HCL配制4、5、6、7、8、9、10等几种不同pH的PDA培养基，将直径为5 mm的菌饼接种于上述不同pH的培养基的中央.其他同1.2.4.1.

1.3 数据处理

用Excel 2010、SPSS 21软件进行数据统计与分析，用Origin 9.0作图，采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树.

2 结果与分析

2.1 油桃酸腐病症状

该病主要发生于油桃果实成熟期，尤其是储藏期发生普遍严重.果实上发病初期(图1-A)有灰褐色的水渍状病斑出现，随着病斑的不断扩大，病斑处开始变软并且有少量的白色霉状物出现(图1-B)，发病后期整个果实变软腐烂而且有大量酸汁液流出，散发出浓烈的酸臭味.

图1 油桃采样发病初期(A)及后期(B)症状Figure 1 Symptoms of nectarine sampling at early stage (A) and later stage (B)

2.2 致病性测定

采用组织分离法从发病的油桃上分离出2株分离物，分别命名为YT-1和YT-2，保存于4 ℃冰箱备用.离体接种结果表明，接种YT-2分离物的(图2-A)油桃复试出现的发病症状与采样症状(图1)相似，而对照(图2-B)和YT-1处理没有形成任何症状；同时，针刺接种YT-2的油桃果实在接种3 d后出现明显病斑，而无伤接种的果实则在接种5～6 d后出现明显的症状，初期出现褐色水渍状病斑，后期长出白色霉层且散发出臭味.且在发病部位再次分离得到接种菌，表明YT-2为油桃酸腐病的致病菌.

2.2 病原菌的鉴定结果

2.2.1 形态特征 将保存的YT-2在PDA培养基上进行活化，25 ℃的恒温培养箱中培养7 d后得到的菌落直径为7.1～7.6 cm，菌落正反面均为乳白色，表面近绒状，菌丝极短，分布有少数白粉状物，菌落放射状生长(图3-A、3-B)，且挥发出酒香味.在显微镜下可以观察到有隔膜的菌丝，无色，有较短的分生孢子梗，老熟菌丝断裂为两头钝圆的长筒形或者椭圆形分生孢子，单个孢子呈不规则分布，大小为4.7～10 μm×3.4～7.5 μm，产孢量多(图3-C、3-D).

图2 油桃果实刺伤接种YT-2分离物的症状(A)及对照组(B)Figure 2 Symptoms of nectarine fruit inoculated with YT-2 isolate (A) and control group (B)

2.2.2 分子生物学鉴定 菌株YT-2的基因序列经过PCR扩增得到大约247 pb的片段，GenBank登录号为MW320456，其序列经过Blast比对表明该菌株与白地霉(Geotrichumcandidum)的同源性较高，相似度高达97.34%，进一步从GenBank数据库选择白地霉及其近缘种的rDNA-ITS序列，与供试菌株构建系统发育树，由系统发育树图4可知，菌株YT-2和Geotrichumcandidum(AB000652.1)以99%的支持率聚在同一分支上，再结合形态学鉴定的结果确定其为白地霉.

A：菌落正面；B：菌落反面；C、D：孢子形态特征.A is the front side of the colony;B is the opposite side of the colony.Both C and D represent the morphological characteristics of spores.图3 菌落特征及孢子形态Figure 3 Colony characteristics and spore morphology

图4 菌株YT-2的ITS序列系统发育树Figure 4 ITS sequence phylogenetic tree of strain YT-2

2.3 病原菌生物学特性

2.3.1 不同温度对菌丝生长和产孢量的影响 由图5可知，供试菌株在25 ℃的恒温培养箱中生长7 d以后的菌落直径显著高于(P<0.05)其他几个处理，菌落直径高达7.85 mm；在该温度条件下的产孢量为1.26×108个/mL，也显著高于(P<0.05)其他几个温度处理，且由图5可以看到，在5～25 ℃该菌株菌落直径和产孢量都在逐渐增加，超过25 ℃以后，两者逐渐降低.说明该菌株在25 ℃的恒温环境中生长的最好，温度过高过低都不利于菌株菌落的生长和产孢.

图5 温度对菌丝生长和产孢量的影响Figure 5 Influence of temperature on mycelial growth and sporulation

2.3.2 不同光照对菌丝生长以及产孢量的影响 通过光照对菌丝生长以及产孢量影响的试验结果(图6)可以看到，12 h光照黑暗交替条件下的菌落直径最高为7.9 cm，显著高于(P<0.05)其他两个处理.但是连续黑暗处理和光照交替处理组的产孢量没有显著差异，都显著高于连续光照处理组.

2.3.3 不同培养基对菌丝生长以及产孢量的影响 由图7 可知，供试菌株在PDA培养基、马丁氏培养基和孟加氏培养基上菌丝生长的较好，菌落直径都达到了6.0 cm以上，且在PDA培养基上菌落直径可以达到7.37 cm，显著高于其他五种培养基(P<0.05)，但是菌落比较疏松稀薄.孟加氏培养基和马丁氏培养基的菌落直径没有显著差异(P>0.05)，仅次于PDA培养基，菌落生长密集且产孢量极高，马丁氏培养基的产孢量显著高于(P<0.05)产孢量排在第二的孟加氏培养基，可达2.22×109个/mL.其他四种培养基的产孢量之间无显著差异(P>0.05)，试验结果表明，最有利于菌丝生长的培养基是PDA培养基；产孢量最高的则是马丁氏培养基；不同培养基的类型对供试菌株的菌落生长以及产孢量都有一定的影响.

图6 光照对菌丝生长以及产孢量的影响Figure 6 Influence of light on mycelial growth and sporulation

图7 不同培养基类型对菌丝生长以及产孢量的影响Figure 7 Effects of different medium types on hypha growth and sporulation quantity

2.3.4 碳源对菌丝生长以及产孢量的影响 由图8 可知，以葡萄糖和果糖为碳源的培养基中菌丝生长的最好，两者之间没有明显差异(P>0.05)，但是显著高于其他五种碳源培养基(P<0.05)，在以葡萄糖为碳源的培养基中菌落直径最高可达7.32 cm，且产孢量也显著高于其他6种(P<0.05)，最高达4.43×109个/mL.结果表明，无论从菌丝生长及产孢量来说，最佳的碳源都是葡萄糖，其次就是果糖.说明碳源对于菌丝生长还是产孢量都有着重要的影响.

图8 不同碳源对菌丝生长以及产孢量的影响Figure 8 Effects of different carbon sources on mycelia growth and spore production

2.3.5 氮源对菌丝生长以及产孢量的影响 由图9 可知，在不同的氮源培养基上菌落的生长直径和产孢量都有很大的差异，蛋白胨做氮源的时候菌落直径最大，可达7.13 cm，显著高于其他几种氮源培养基(P<0.05)，且产孢量最高达3.35×109个/mL.牛肉膏和硝酸钾的菌落直径次于蛋白胨，两者之间没有显著差异(P>0.05)，但是牛肉膏的产孢量却显著高于硝酸钾(P<0.05).试验结果表明，适合菌丝生长的最佳氮源是蛋白胨，产孢量最高的是蛋白胨和牛肉膏，氮源对于菌丝生长和产孢量有着重要的影响.

图9 不同氮源对菌丝生长以及产孢量的影响Figure 9 Effects of different nitrogen sources on hypha growth and spore production

2.3.6 pH对菌丝生长以及产孢量的影响 由图10 可知，不同pH值的培养基中菌落直径和产孢量都是不同的，pH等于10的时候菌落直径最大为7.15 cm，显著高于其他(P<0.05)，随着pH值的降低，菌落直径的大小也在下降.然而pH值为4的时候产孢量最高且显著高于其他(P<0.05)，pH为8时产孢量最低.该菌随着pH值的增大菌落直径也在缓慢增大，但是随着pH值的增大产孢量不断减小，说明该菌适应的pH范围比较广.

图10 不同pH值对菌丝生长以及产孢量的影响Figure 10 Effects of different pH values on mycelia growth and spore production

3 讨论与结论

本研究通过对油桃酸腐病症状的观察、病菌的分离纯化、致病性测定、以及形态学和分子生物学鉴定，证明引起油桃酸腐病的病原为白地霉(Geotrichumcandidum).这是国内首次比较系统的对油桃酸腐病的报道.白地霉寄主范围比较广泛，可侵染荔枝[21]、番茄[22]、胡萝卜[23]、欧李[24]和太子参[25]等多种蔬菜、水果和中药材引起酸腐病，造成果实腐烂，严重影响其商品价值和经济价值.

本研究发现，该病原菌最适生长温度为25 ℃，最适菌丝生长的光照条件为12 h光暗交替，在4～10的pH范围内该病原菌均可以生长，pH为10时菌落直径最大，其中温度和光照条件的研究结果与蔡学清等[26]的研究结果相似.白地霉(G.candidum)在不同种类的培养基上都可以生长，在PDA培养基中菌丝生长的最好，在马丁氏培养基中产孢量最高，而在查氏培养基和合成低营养琼脂培养基中菌丝生长缓慢且产孢量都不高，这可能是因为白地霉并不适合在微量成分复杂的培养基中生长，影响其生长的微量元素还需进一步研究.无论是从菌丝生长还是从产孢量来看，该菌株生长的最佳碳源均为葡萄糖，其次是果糖和蔗糖，在无碳培养基和可溶性淀粉培养基中生长差异最低且两者之间不显著，这与果实成熟期果糖和葡萄糖含量达最大值一致.最佳的氮源是蛋白胨，在无氮源的培养基和尿素培养基中生长状况差，说明白地霉的生长对于氮源有很严格的要求，成分复杂的有机氮源比无机氮更有利于该病原菌的生长，这与高莹等[27]的研究结果相似.

酸腐病主要发生在果实采后储藏期，研究发现，病原菌容易从伤口侵入，同时低温(5 ℃)条件下病原菌生长缓慢，因此，在油桃采收时，为了避免酸腐病的严重发生，应当尽量使果实少受机械损伤，并且及时进行低温保存.对油桃酸腐病的病原菌鉴定及生物学特性的研究结果可为进一步研究和防治油桃酸腐病提供相关理论依据.