黑果枸杞微卫星DNA与花青素、多酚和黄酮的关联分析

陈小瑛，孔东升,,3，王立，陈艳霞，柯善文

(1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070；2.河西学院，甘肃 张掖 734000；3.甘肃省黑果枸杞工程研究中心，甘肃 张掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)的多年生耐盐、抗旱灌木.主要分布于我国新疆、内蒙、青海、宁夏及陕西东部等地[1]，是干旱荒漠区重要的水土保持树种.其果实也是迄今为止发现含原花青素最高的野生植物[2]，且药食兼用，具有强肾、润肺、明目、健胃、补脑、抗衰老及通经作用[3].关于黑果枸杞果实的研究大多集中在有效成分的药理作用[4-6]、化学成分[7-8]、以及微量元素[9-10]等方面.

SSR(simple sequence repeats，SSR)标记是近年发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称微卫星DNA，是一类由几个碱基组成的串联重复序列.每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，串联重复而成的DNA序列数量丰富、覆盖整个基因组、揭示的多态性高[11].它以孟德尔方式遗传，呈共显性[12-14].微卫星DNA以遗传基因组学为基础，是植物有效成分生物合成途径中的分子机制.植物中次生代谢产物的合成和积累受遗传基因控制，由其自身生物遗传特性决定[15].李瑞明[16]、张蕊[17]、楚秀丽[18]，分别通过研究不同种源的毛脉酸模根、2年生南方红豆杉、青钱柳叶片黄酮类物质，揭示了不同地理种源(基因型)对次生代谢产物积累的不同影响及作用.徐茂军[19]研究了细胞内部的信号转导系统对植物次生代谢产物合成的影响，表明植物体内次生代谢物质的合成受细胞内部相关基因调控.

目前，黑果枸杞在分子水平上的研究已取得一定的进展.林丽[20]、阿力·同其米克[21]用ISSR分子标记对黑果枸杞进行遗传多样性研究，分析了不同居群间的相关遗传参数，表明所研究的黑果枸杞有高的遗传多样性且遗传背景复杂.尹跃[22]、黄兴发[23]则对黑果枸杞分子标记进行开发，为黑果枸杞构建遗传图谱以及遗传多样性的研究提供了可行的标记选择.许兴[24]等利用RAPD分子标记技术,对不同地区主要栽培的宁夏枸杞品进行了分析，构建了主要推广品种宁杞1号的RAPD图谱.但是以SSR分子标记分析微卫星标记与黑果枸杞数量性状关联研究未见报道，这使得黑果枸杞在分子标记辅助育种以及遗传多样性方面的研究进程缓慢，导致人们无法充分合理的开发和利用该资源.

本试验采用SSR分子标记的方法，选择已经发表的枸杞分子标记开发的相关报道中的23个微卫星标记[25-26]，与黑果枸杞果实中花青素、多酚和黄酮的相关性进行研究.以期为黑果枸杞分子标记辅助育种、遗传图谱的构建和优良品种选育提供参考，并为黑果枸杞分子育种和产业发展奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年9月对甘肃省玉门的黑果枸杞进行种质资源调查、收集与研究.该地区属于大陆性温带干旱气候，昼夜温差大，平均海拔1 200 m，年平均气温7.5 ℃，年平均降水量63.3 mm，蒸发量2 952 mm.通过树势、树高、冠幅、干高、胸径、叶片形状、果实特征等表型数据初选黑果枸杞优树100株，采摘其果实，进行相关处理并在实验室进行花青素、多酚和黄酮含量的测定.以花青素含量为主要经济性状，按照K-均值聚类法以相似性原则将其分为高、中、低3类，在3类中分别选取14株作为SSR分子标记试验材料.

1.2 主要试验试剂

香草醛、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、没食子酸标准品、芦丁标准品、福林酚、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、盐酸、硫酸均为分析纯、甲醇为色谱纯、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit、Agarose D-1 LE、DL10,000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、6×DNA Loading Buffer、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)购于宝日医生物技术有限公司，12% Precast-GLgel Tris-Glycine电泳预制胶购于上海生工生物工程股份有限公司.

1.3 试验仪器

恒温水浴锅(型号 DK-98-Ⅱ天津市泰斯特仪器有限公司)、索氏提取器、紫外可见分光光度计(型号UV-1701PC)、高通量组织研磨器、小型离心机、BIO-RAD梯度基因扩增仪(T100，时代联想生物技术有限公司)、垂直电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、水平电泳仪(DYCP-32A,北京六一仪器厂)、UVP凝胶成像系统(GelDoc-It 2315).

1.4 试验方法

1.4.1 花青素含量的测定 花青素含量的测定参照贺盼[27]试验方法进行.绘制标准曲线，然后取上清液，在分光光度计545 nm处测其吸光度，试验重复3次.采用硫酸-香草醛法测定含量.其计算公式计算为：

含量(%)=(Ax×Cr/Ar)×D/W×100%

式中：Ar为对照品溶液吸光度，Ax为供试品溶液吸光度，Cr为对照品溶液浓度，D为稀释倍数，W为试验材料质量.

1.4.2 多酚含量的测定 多酚含量的测定参照祁

银燕[28]试验方法进行.建立标准曲线，取上清液，在分光光度计765 nm处测吸光值,试验重复3次.计算公式如下：

含量(mg/g) =(X1×V1×V2)/W

式中：X1为根据标准曲线计算得样品浓度值(mg/mL),V1为提取液稀释倍数,V2为提取液总体积(mL),W为原料干质量(g).

1.4.3 黄酮含量的测定 黄酮含量的测定参照李淑珍[29]方法进行.建立标准曲线，取上清液，在分光光度计510 nm测其吸光度，实验重复三次.计算公式如下：

式中：y是样液浓度(mg/mL)，v1是样液体积(mL)，v2是样品定容体积(mL)，v3是显色反应测定时取用样液体积(mL)，m是样品量(g).

1.4.4 引物的种类与合成 试验所引用的23个微卫星标记来源于已经发表的枸杞分子标记开发的相关报道，引物名称和退火温度详见表1.其由上海生工生物工程股份有限公司合成.

表1 23个引物相关资料

1.4.5 DNA的提取与检测 采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，配置1%琼脂糖凝胶将提取的DNA进行电泳，-20℃保存.

1.4.6 PCR反应体系与扩增程序 PCR反应体系：总体积为10 μL，其中模板DNA为0.5 μL，上下游引物共0.5 μL，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 5 μL，dH2O 4 μL.

PCR扩增程序：98 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃后延伸5 min，PCR产物-20 ℃保存.

1.4.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用12%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行检测，并以DL2000 DNA Marker作为参照.电泳电压为150 V，时间为1 h，等标准参照染料跑至胶板底部时，切断电源，停止电泳.取出凝胶后采用硝酸银染色后进行凝胶成像.

1.5 统计分析

参照DL2000 DNA Marker，并利用Gene Mapper 4.0软件判定所有样品的基因型.用Microsoft Excel对初始数据进行整理.用popgene 32.0计算微卫星有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(E_Het)等群体参数，按照以下公式计算多态信息含量(PIC)[30]，其中m为等位基因数量，Pi为第i个等位基因的频率.

用SPSS 25.0进行正态分布检验与方差分析.用单因素ANOVA法对微卫星位点不同基因型与经济性状进行相关性分析，若微卫星位点与性状间具有显著性差异，则用LSD进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 性状分布

对黑果枸杞青花素、多酚和黄酮含量进行正态分布检验(表2)，三者P值均大于0.05，说明其含量频率分布均符合正态分布.

表2 花青素、多酚和黄酮的正态性检验

2.2 电泳结果

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 对提取的42株黑果枸杞果实的DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图1所示，展示了部分样品DNA提取结果.

2.2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用23对微卫星引物对42个样本基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，各微卫星均获得了稳定、清晰的DNA条带,并在个体间表现出不同程度的多态性.图2显示位点KY284848对部分黑果枸杞个体扩增结果.

2.3 遗传多样性分析

23个微卫星位点遗传多样性信息见表3.共检测到89个等位基因，平均为3.87个，其中位点KY284849、KY284856、KY28485均为5个.Ne最多的是KY284856(3.84)，最少的是c23113-g1(1.96)，平均为2.98.观测杂合度在0.43～0.90之间，多态信息含量在0.41～0.69之间.

M表示Marker DL10000；1～10分别表示10个样本个体.M means Marker DL10000；1～10 means 10 sample individuals respectively.图1 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNAFigure 1 Detection of DNA by 1% agarose gel electrophoresis

M表示Marker DL2000，1～14为14个样本个体.M means Marker DL2000；1～14 are 14 sample individuals.图2 位点KY284848 在黑果枸杞的PCR产物检测结果Figure 2 The detection result of PCR product of site KY284848 in Lycium ruthenicum

表3 黑果枸杞23个微卫星位点多态信息

2.4 微卫星标记与花青素、多酚、黄酮的关联分析

运用SPSS软件对各位点不同基因型与所对应的花青素、多酚和黄酮含量的差异情况进行方差分析，结果发现5个微卫星标记与黑果枸杞的经济性状有关联.

由表4可知，位点c88061_g1_i1在含量高的水平上，不同基因型之间花青素含量呈显著差异(P<0.05).在4种基因型中，CD显著高于AC(P<0.05)，AB和CC无显著差异(P>0.05)，在含量中的水平上，AC黄酮含量显著高于AB(P<0.05).

由表5可知，位点c60533_g1_i1在含量低的水平上，不同基因型之间多酚含量呈显著差异(P<0.05).在3种基因型中，AA显著高于AB和BC(P<0.05)，AB和BC无显著差异(P>0.05).

由表6可知，位点c58466_g1_i1在含量中的水平上，不同基因型之间花青素呈显著差异(P<0.05)，AC显著高于AD(P<0.05),AB与AC和AD无显著差异(P>0.05).

表4 位点c88061_g1_i1不同基因型间黑果枸杞性状差异

表5 位点c60533_g1_i1不同基因型间黑果枸杞性状差异

表6 位点c58466_g1_i1不同基因型间黑果枸杞性状差异

由表7可知，位点KY284852在含量低的水平上，不同基因型之间花青素和多酚含量之间呈显著差异(P<0.05)，BD花青素、多酚含量显著高于AD(P<0.05)，BD、CD和BC无显著差异(P>0.05).

由表8可知，位点KY284857在含量中的水平上，不同基因型之间多酚含量呈显著差异(P<0.05).BD显著高BC(P<0.05)， BD和BB之间无显著差异(P>0.05).

表7 位点KY284852不同基因型间黑果枸杞性状差异

表8 位点KY284857不同基因型间黑果枸杞性状差异

3 讨论

3.1 黑果枸杞遗传多样性分析

生物群体遗传变异是生物进化的原始材料，遗传多样性则是物种生存、发展和进化的基础.按照Botstein[31]对于遗传多样性的判别标准，选用的23个微卫星座位中，18个位点的PIC>0.5为高度多态性座位，5个位点0.25

3.2 微卫星标记与花青素、多酚和黄酮的关联分析

QTL连锁分析是对不同基因型个体的数量性状表型应用统计学的方法，进行显著性检验,如果差异显著说明微卫星标记与数量性状存在关联[37].利用SSR分子标记方法进行的关联分析不需要建立遗传图谱，可以直接对位点基因型与所对应的性状之间的差异进行关联分析.SSR与经济性状的关联分析在水稻[38]、大麦[39]、大豆[40]、油菜[41]等作物中应用较多，可见关联分析在发掘位点、寻找优良变异类型方面有明显的优势.

但关联分析在黑果枸杞中的研究鲜见，究其原因有：对枸杞群体结构、表型及基因型鉴定的分析不足，影响了人们对相关基因的标记开发；表型差异与环境的相互作用，使得人们对QTL功能的认知不足.赵建华等[42]对枸杞部分农艺性状形成的分子机制进行了研究，克隆到LbA1基因,在分析中发现LbA1基因表达量与枸杞果实果糖含量达到极显著相关.朱雪冰等[43]克隆了黑果枸杞中调节花青素合成代谢的MYB基因.本试验用SSR分子标记方法对花青素、多酚和黄酮与位点基因型进行关联分析.结果发现：位点c88061_g1_i1与花青素和黄酮相关；c60533_g1_i1、KY284857与多酚相关；c58466_g1_i1与花青素相关；位点KY284852与花青素和多酚相关，存在一因多效和多因一效现象，说明这些标记位点可能是控制花青素、多酚、黄酮的主效基因,或与控制数量性状的主效基因连锁.在生产实践中，选择具有和优良性状相关的标记进行个体选育，可最大限度发挥黑果枸杞的某些经济性能，提高其经济价值.试验中检测到与数量性状相关的位点较少，可能是因为所用材料遗传丰富度不够、选用的微卫星标记数量有限.

通过数量性状与分子标记相关性分析，可找到与黑果枸杞经济性状相关联的标记，从而选择和定位数量性状基因，以此用于分子标记辅助选择育种，可以提高黑果枸杞优选效率.上述所说的微卫星标记与黑果枸杞花青素、多酚、黄酮的关联分析只是初步研究，还需要扩大样本量进行进一步的研究，但本试验研究结果从分子水平上为黑果枸杞的早期选育、高效育种和遗传改良提供了理论依据.

4 结论

1) 试验所选用的23个微卫星位点中，平均多态信息含量(PIC)为0.59，平均观测等位基因数为3.87，期望杂合度在0.49～0.75之间，说明该群体遗传多样性处于较高水平，并且有较强的遗传潜力.

2) 关联分析发现23个位点中，有5个与黑果枸杞中花青素、多酚和黄酮有关联，所筛选出的微卫星位点，可以为黑果枸杞早期的良种选育提供依据.