小麦TaGSK5基因的克隆与表达分析

张令慧，张沛沛，刘媛，陈涛，王彩香，程宏波，杨德龙

(1.甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

小麦(Triticumaestivum)是我国四大主粮作物之一，主要分布在北方雨养农业区.随着全球气候的变化，淡水资源日益匮乏，土壤盐渍化加剧，小麦在发育时期更易遭受干旱、低温、干热风、盐渍化等非生物胁迫，致使小麦生长发育异常，产量和品质显著下降[1].为应对各种非生物胁迫的危害，小麦在长期的进化过程中形成了一系列的生理生化调控机制[2-4].许多基因在小麦非生物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用[5-6].因此，深入发掘优异的抗逆基因，解析其生物学功能，对小麦抗逆分子遗传改良具有重要意义.

糖原合成激酶(glycogen synthase kinase 3/shaggy like kinase，GSKs)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族[7]，在响应植物非生物胁迫和参与植物生长发育调控方面起重要作用.近几年，GSKs基因相继在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、苜蓿(Medicagosativa)[9]、棉花(Gossypiumspp.)[10]和水稻(Oryzasativa)[11]中被发现与克隆.研究发现，GSK家族成员蛋白的激酶结构域高度保守的[12]，在水稻和拟南芥GSK-like激酶结构域的结构相似性达75%[13].GSKs能够磷酸化多个下游底物来发挥生物学功能[14].BR信号通路的GSK3的同系物BIN2是通过磷酸化和去磷酸化控制BR信号传导下游的转录因子BRZ1和BES1/BZR2来阻止信号转导，通过负向调节作用进而诱导其他生化反应[15]，而拟南芥ASKa是通过激活Glu-6-磷酸脱氢酶(G6PD)来调节应激耐受性[16].植物中的GSKs是一个多基因家族[17]，在拟南芥中已经鉴定出10个GSKs家族成员[18]，水稻中包含9个[19].进化分析表明，植物GSKs家族成员可分为Ⅳ个亚家族[20]，其中已经被鉴定的第Ⅳ亚家族基因AtSK11[21]、OsGSK5[22]和MsK4[9]受非生物胁迫诱导并且具有激酶活性.在拟南芥中，AtSK11受NaCl、干旱、ABA、热诱导上调表达[21]，研究发现高盐胁迫能够快速诱导糖原合成激酶MsK4上调表达[9].水稻OsGSK5通过调节碳水化合物的代谢平衡从而调高了植物对盐胁迫的耐受性[22].上述研究表明，植物GSKs的第Ⅳ亚家族成员在逆境胁迫响应中发挥重要作用.然而，截止目前有关小麦GSK基因的克隆和响应非生物胁迫的研究尚未见报道.因此，本研究拟克隆小麦TaGSK5基因并对其序列进行生物信息学分析和表达分析，以期为进一步研究小麦TaGSK5基因生物学功能提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取陇中1号为供试材料，该品种适宜在甘肃兰州和陇东地区、宁夏固原地区、陕西延安地区的旱地冬麦区种植.陇中1号在本实验室基地种植抗旱效果较好.

1.2 处理方法

挑选籽粒大小一致、圆润饱满的陇中1号小麦种子置于培养皿上，4 ℃黑暗处理2 d后置于人工气候室内，在光照强度为62.5 μmol/(m2·s)，光周期为16 h/8 h，温度为25 ℃条件下进行培养.待幼苗长至两叶一心时(14 d)，对小麦幼苗进行非生物胁迫处理.将采用水培法培养的小麦幼苗置于20% PEG-6000溶液和200 mmol/L的NaCl的溶液中培养，分别在处理后0、1、3、6和12 h的时间点采集小麦幼苗各组织，液氮速冻后，-80 ℃超低温保存备用.

1.2.1TaGSK5基因cDNA的引物设计 以水稻OsGSK5的cDNA为参考序列(XP_015633107)，在小麦数据库网站(http://202.194.139.32/blast/viroblast.php)中检索其在小麦中的同源基因，通过序列比对获得小麦TaGSK5的4个同源候选基因，命名为TaGSK5-1A，TaGSK5-4A，TaGSK5-5B及TaGSK5-5D.利用Primer premier 5.0软件设计通用引物进行小麦陇中1号的TaGSK5基因扩增：引物序列为TaGSK5-F(5′→3′):CAATCAGCTAGGAGATGGCGTA和TaGSK5-R(5′→3′)：CACCCACACAAAGCTACAGCT，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.2.4 生物信息学分析 运用ExPASy-ProtParam对小麦TaGSK5的二级结构及蛋白的理化性质进行预测；运用ExPASy-ProtParam构建TaGSK5蛋白的三级结构；使用WoLFPsort (www.gens cript.com/wolf-psort.html)预测TaGSK5的亚细胞定位；在NCBI网站搜索不同物种的GSK同源蛋白并利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对；使用STRING(https://string-db.org/cgi/input)预测TaGSK5蛋白的互作网络；采用MEGA 7.0软件构建小麦、水稻、拟南芥、苜蓿、大麦和粗山羊草等8个物种GSK同源蛋白的系统进化树；在WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/ WheatExp/)数据库下载小麦不同组织(根、茎、幼穗、叶和籽粒)TaGSK5基因的表达谱数据，利用TBtools软件绘制表达谱数据热图.

2 结果与分析

2.1 TaGSK5基因cDNA的克隆及基因结构

以小麦陇中1号叶片的cDNA为模板，使用特异性引物TaGSK5-F和TaGSK5-R扩增目的片段，扩增产物经电泳检测，在1 200 bp左右出现1个特异性条带(图1).将目的条带回收纯化、转化大肠杆菌，挑选阳性克隆测序验证.测序结果与中国春的4条序列进行比对.结果表明，不同单克隆菌的序列信息与1A、4A、5B和5D染色体上中国春释放的序列信息相一致，将其命名为TaGSK5.所得到的4个TaGSK5基因cDNA序列，分别位于小麦的1A、4A、5B和5D的染色体上，故将其分别命名为TaGSK5-1A、TaGSK5-4A、TaGSK5-5B和TaGSK5-5D.通过基因结构分析发现，TaGSK5的4个部分同源基因都编码426个氨基酸且均由12个外显子和11个内含子组成(图2).

M：DL5000 DNA marker；1：TaGSK5基因的扩增产物.M:DL5000 DNA marker;1:The amplification products of TaGSK5 gene.图1 TaGSK5基因cDNA序列扩增Figure 1 The cDNA amplificated products of TaGSK5 gene

图2 TaGSK5的基因结构Figure 2 The gene structure of TaGSK5

2.2 TaGSK5基因编码的氨基酸序列比对及进化树分析

使用DNAMAN对小麦TaGSK5与水稻(XP_015633107)、苜蓿(AF432225)和拟南芥(At1g 09840)的氨基酸序列进行多重比对(图3)，结果表明，小麦TaGSK5的4个同源基因氨基酸相似性达到99.43%，4个物种间的同源性在70%以上，TaGSK5与水稻相似性较高(>90%)，与苜蓿和拟南芥的同源性较低.他们的GSK激酶(88-375)结构域高度相似，其中的功能基序TREE、CDFGSAK和SYICSR的序列较一致，表明TaGSK5蛋白在进化过程中具有较强的保守性.进化分析表明，TaGSK5的4个部分同源基因和粗山羊草处于同一个分支(图4)，说明祖先种来源于粗山羊草.

2.3 TaGSK5蛋白二级及三级结构预测

通过(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/)在线软件预测了TaGSK5的4个同源蛋白的二级结构组成，结果表明这4个蛋白二级结构的比例均由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠构成(表1).TaGSK5-5B、TaGSK5-5D、TaGSK5-4A和TaGSK5-1A蛋白的二级结构α-螺旋分别占36.71%、36.71%、36.85%和37.32%，无规则卷曲分别占42.72%、40.24%、42.02%和40.85%，延伸链分别占15.26%、16.24%、15.73%和15.49%，β-折叠分别占6.34%、6.82%、5.40%和6.34%.通过(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件构建TaGSK5蛋白的三级结构，因TaGSK5的4个同源蛋白的氨基酸序列高度相似，同源建模选用的蛋白模型相同，故使用TaGSK5-5B蛋白序列构建三级结构(图5).由图5可知，TaGSK5-5B蛋白的结构两端是由少部分的β-折叠，中间是α-螺旋由无规则卷曲串联起来的空间结构，主要是以α-螺旋和β-折叠形成的特殊结构来行使激酶功能.

表1 TaGSK5蛋白的二级结构预测

黑色方框：GSK蛋白激酶催化结构域；绿色背景：ATP结合位点；黄色背景和灰色背景：分别为高度保守基序CDFGSAK和SYICSR，仅存在于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK-3亚家族成员；红色背景：植物中的保守基序TREE.Black box：GSK protein kinase catalytic domain；Green background：ATP binding site；Yellow and gray backgrounds shows highly conserved motifs CDFGSAK and SYICSR，respectively，which are only present in the members of the GSK-3 subfamily of serine/threonine protein kinases；Red background：TREE is the conservative motif in plants.图3 小麦TaGSK5与其他物种同源蛋白的氨基酸序列比对Figure 3 Alignments of amino acid sequences of wheat TaGSK5 with homologous proteins of other species

图4 小麦与其他物种GSK蛋白的进化分析Figure 4 Phylogenetic tree of GSK from wheat and other species

图5 TaGSK5蛋白的三级结构图Figure 5 Prediction of the tertiary structure of TaGSK5

2.4 TaGSK5蛋白的理化性质、亲疏水性及磷酸化位点分析

利用EXPASY-ProtParam在线网站预测TaGSK5蛋白的理化性质(表2).结果显示，这4个同源蛋白的理化性质非常接近.TaGSK5-5D、TaGSK5-5B、TaGSK5-4A和TaGSK5-1A的等电点非常接近，等电点分别为8.53、8.57、8.79和8.54；分子量分别为48 226.51、47 602.69、48 237.52和48 314.58.通过EXPASY-ProtParam网站预测TaGSK5蛋白质的亲疏水性，亲水性的氨基酸明显多于疏水性蛋白，表明TaGSK5蛋白质为亲水性蛋白(图6).利用EXPASY-ProtParam网站预测小麦TaGSK5蛋白磷酸化位点，发现TaGSK5蛋白有丝氨酸位点13个、苏氨酸位点8个、酪氨酸位点6个.表明该蛋白可能通过不同的磷酸化底物实现基因的调控功能(图7).

表2 TaGSK5基因编码的蛋白质的理化性质

垂直线零点以下代表相对的亲水区，零点以上为疏水区.The vertical line below the zero point represents the relative hydrophilic area，and the vertical line above the zero point represents the hydrophobic area.图6 TaGSK5蛋白的亲疏水性预测Figure 6 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of TaGSK5

图7 TaGSK5蛋白磷酸化位点预测Figure 7 Prediction of phosphorylation site of TaGSK5

2.5 TaGSK5蛋白的亚细胞定位及互作蛋白网络

利用WOLFPSORT在线软件预测分析TaGSK5蛋白亚细胞定位，这4个同源蛋白主要分布在细胞质、细胞核、线粒体和过氧化物酶体中，但在细胞核和线粒体中的比例较高(表3)，且TaGSK5蛋白没有信号肽结构，表明该蛋白不属于分泌蛋白.利用STRING在线软件对TaGSK5的互作蛋白预测(图8)发现，与TaGSK5互作的蛋白中有4个丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶、2个cGMP依赖性蛋白激酶、1个具有Kelch样重复结构域的蛋白磷酸酶、1个PKG_like.1-ACG激酶和1个蛋白磷酸酶.

表3 TaGSK5的亚细胞定位预测

2.6 TaGSK5基因的表达特性分析

通过分析WheatExp数据库中TaGSK5基因在不同组织的表达谱数据，发现TaGSK5基因在小麦不同组织中均有表达，茎和穗中表达高于其他组织，在穗中的表达量最高(图9).通过qRT-PCR检测发现，小麦幼苗在干旱胁迫处理0～6 h时该基因表达量显著下调，在6～12 h时该基因的表达量上升.在NaCl处理下TaGSK5基因的表达量没有发生显著变化(图10).

Traes_1DL_379E66DDF.2和Traes_1BL_8FF2B3EDB.2：拓扑异构酶1相关因子1；Traes_1AS_B064460F3.1、Traes_1DS_F6BDFABDF.1和Traes_1BS_9DF369DD41.1：Kelch重复域的蛋白磷酸酶；Traes_6BL_DFDCD5B11.1：AGC_PKA / PKG_like.1-ACG激酶；Traes_5AL_CD9481C81.1：丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶；Traes_6DS_C7EA481F4.2：蛋白磷酸酶2C；Traes_1AL_D5664FB85.2，Traes_1BS_9DF369DD4.1与Traes_1BS_9DF369DD41.1：含八糖肽或四三肽重复(TPR)的蛋白质.Traes_1DL_379E66DDF.2 and Traes_1BL_8FF2B3EDB.2：Topoisomerase 1 related factor 1；Traes_1AS_B064460F3.1，Traes_1DS_F6BFABDF.1 and Traes_1BS_9DF369DD41.1：Kelch repeat domain protein phosphatase；Traes_6BL_DFDKG_PKGC5B11.1:AGC_PKA / PKG_like.1-ACG kinase；Traes_5AL_CD9481C81.1：serine/threonine protein phosphatase;Traes_6DS_C7EA481F4.2：protein phosphatase 2C;Traes_1AL_D5664FB85.2，Traes_1BS_9DF369DD4.1 and Traes_1BS_9DF369DD41.1：proteins containing octa-glycopeptide or Tetratrieptide Repeat (TPR) domain.图8 TaGSK5蛋白的互作网络Figure 8 Interaction network of TaGSK5

G：籽粒；L：叶片；R：根部；S：穗部；ST：茎部.G：Grain；L：Leaf;R：Root；S：Spike；ST：Stem.图9 TaGSK5基因在不同组织中的表达量Figure 9 TaGSK5 gene expression in different tissues

3 讨论

糖原合酶激酶3(GSK3)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种多功能激酶[7].大多数已经被克隆出的GSK基因参与非生物胁迫响应[22-23].本研究从小麦陇中1号中克隆了4个TaGSK5的cDNA序列，序列长度1 281bp.在水稻中，OsGSK5包含12个内含子和11个外显子[6]，与在本研究中TaGSK5的4个同源基因的基因结构一致.他们所编码的蛋白无论从基因结构、理化性质还是蛋白结构域都高度相似[22].氨基酸序列比对显示，TaGSK54个部分同源基因所编码的蛋白的序列相似性达98%，与拟南芥、水稻和苜蓿中同源基因具有很高的相似性[9,11,21].本研究发现小麦TaGSK5的4个部分同源基因的激酶结构域高度保守，其中TREE结构域在不同物种中都存在[11].最近研究发现，GSK激酶结构域在不同植物中的功能基序高度相似，拟南芥bin2-1突变体出现矮化的表型是由于TREE基序突变，抑制了GSK蛋白激酶的活性所引起[11]，表明功能基序在植物中激活激酶活性及蛋白功能的发挥具有作用.

A：PEG处理；B：NaCl处理.图柱上不同字母表示差异显著(P<0.05).A:PEG treatment;B：NaCl treatment.Different letters on the bar indicate significant differences (P<0.05).图10 在PEG和NaCl处理下TaGSK5的差异表达量Figure 10 Differential expression of TaGSK5 under PEG and NaCl treatment

进一步研究表明，GSK基因通过磷酸化下游蛋白来调控植物的生理过程[23-24].在水稻中的OsSK22介导OsBZR1磷酸化从而调控BR信号通路[25]，本研究预测出TaGSK5蛋白有13个丝氨酸、8个苏氨酸和6个酪氨酸磷酸化位点，推测小麦TaGSK5蛋白通过磷酸化下游底物来调控不同的生物学过程.基因表达谱分析显示，TaGSK5在小麦的根、茎、叶和穗中均有表达，但在不同组织间的表达水平存在显著差异，其中在茎和穗中的表达量较高，而在叶和根中表达量较低.不同物种GSK基因在非生物胁迫处理下基因表达量也不尽相同.Wang等[10]报道了棉花中的第四亚家族成员GhSK42在盐胁迫处理下没有显著性的变化，而苜蓿MsK4和水稻OsGSK5过表达后分别提高了苜蓿和水稻对非生物胁迫的耐受性[9,22]，本研究发现TaGSK5基因在干旱胁迫下表达量逐渐降低，而在盐胁迫下表达量没有显著变化.结果说明，不同植物中的GSK5基因在非生物胁迫中的响应机制不尽相同，本研究推测小麦TaGSK5基因负调控小麦耐旱性.关于该基因在非生物胁迫中的具体调控机制，还有待于进一步的研究.

4 结论

本研究克隆出的小麦TaGSK5基因，包含4个部分同源基因，其基因结构、保守结构域及蛋白的理化性质非常相似.TaGSK5基因在不同组织具有不同表达模式，在干旱胁迫TaGSK5下调表达，不响应盐胁迫，研究结果为进一步探究小麦TaGSK5基因的功能提供了理论依据.