碱胁迫对白柳根系生长及光合特征参数的影响

王晓，冉馨，高小宽，梁海永，黄晓茜，刘炳响,3

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071000；2.衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000；3.河北省城市森林健康技术创新中心，河北 保定 071000)

全球20%以上的土地正在受到盐碱胁迫的侵蚀，且状况不断恶化[1].我国盐碱地面积大，在土地资源锐减、人口不断增加的压力下，盐碱地改良利用愈发受到人们的重视[2].一定适宜范围的环境是植物生长发育的必要条件，一旦环境因子的变化程度超出了植物正常生活所能忍耐的范围，便会对植物的生长生理造成损害，甚至导致死亡，土壤盐碱化便是环境胁迫的主要类型之一.土壤碱化与盐化是两种性质不同的非生物胁迫，通常将NaCl和Na2SO4等中性盐引起的胁迫称为盐胁迫，而将由Na2CO3和NaHCO3等碱性盐为主的胁迫称为碱胁迫[3]，但因其往往相伴而生，易被混淆.实际上碱胁迫因其土壤溶液pH值较高会使植物遭受盐分与高pH的双重损伤，伤害作用较盐胁迫更为严重和复杂[4-6].一些植物为了生存，能在一定程度上改变自身结构与功能，从而适应环境条件的变化[7].通过生物技术选育耐碱树种是目前解决土壤碱化问题最主流且有效的生物学措施之一，这一举措不仅能扼制土地盐渍化，改良土壤，又可以实现盐碱地的利用，对改良利用盐碱地意义重大[8].白柳(SalixalbaL.)为杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix))落叶乔木，是一种绿化、材、药兼用的经济树种，主要以扦插繁殖为主，对干旱、贫瘠和盐碱等逆境具有很强的适应性[9].目前，有关白柳繁殖及耐盐碱造林试验已有相关研究报道[10-12]，但有关碱性盐胁迫下柳树的适应性机制研究尚未见报道.

根系作为植物进行物质交换的主要器官之一，因其与逆境胁迫直接接触，成为最先且主要的受害器官.已有研究表明，植物的抗碱能力主要取决于根[13-14].光合作用是植物物质能量来源的关键代谢过程，碱胁迫能显著改变叶片的细胞结构[15]，阻碍光合作用的进行，降低光合速率，同时会对植物的PSⅡ反应中心造成损伤，抑制PSⅡ的原初光化学反应和电子传递过程[16]，所以光合荧光参数的改变可以反映光合生产的变化和胁迫因子对植物的作用程度.白柳具有较强的逆境适应能力，在盐碱地生态治理中具有较大的应用推广潜力.因此，本试验以白柳插条为对象，人工模拟碱性土环境下扦插育苗过程，研究不同土壤溶液pH值下的碱胁迫对白柳根系生长状况的影响，并通过JIP-test分析[17-18]碱胁迫下光合特征参数的变化，探讨白柳耐碱特性，以期为白柳碱胁迫适应性机制研究及盐碱地区白柳应用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

供试材料采自河北省怀安县金沙滩林场种质资源圃，在12月份落叶之后选取长势基本一致、生长健壮无病虫害的当年生白柳枝条.选取枝条中部的三分之二，截成20 cm长的插条，其中插条最上部的芽离插条顶端距离为 0.5～1 cm，上切口为平切口，下切口为斜切口.随即于2019年12月23日在河北省保定市河北农业大学人工气候室开展试验.气候室设定温度为28 ℃/25 ℃(光/暗)，LED冷光源控制光照强度1 000 μmol/(m2·s)，光周期14 h/10 h(光/暗)，相对湿度60%.

将试材放置于55 cm×38 cm×15 cm(长×宽×高)塑料箱中进行水培.试验共设5个处理，每个处理3次重复.以1/2 Hoagland完全营养液为本底配制pH值分别为8.0、8.5、9.0、9.5(mNa2CO3：mNaHCO3=1∶1配制)的水培溶液，并以1/2 Hoagland完全营养液为对照(pH为7.2).每个处理共放置约25株插条，将其直接浸泡在溶液中，溶液约没过插条高度的一半.在生长过程中每隔5 d更换营养液，换之前将插条取出用清水小心冲洗根部，将上次残留溶液冲洗掉，防止碱性过度积累.在碱胁迫持续处理20 d后进行各项生长生理指标的测定.

1.2 测定项目及方法

1.2.1 根系生长参数的测定 在白柳生长过程中统计全部插条的根萌动天数与生根率，并依据根萌动天数计算其生根指数.碱胁迫处理20 d后选取长势均匀的5株插条，测量其平均根数和平均根长.

生根指数=∑Gt/Dt

式中：Dt为生根试验第t日；Gt为第t日的生根枝条数，生根指数是生根枝条数/逐日之和.

1.2.2 叶片光合参数的测定 碱胁迫处理20 d后测定白柳叶片光合气体交换参数.每个处理选取5株长势均匀插条进行试验，采用Li-6800便携式光合作用仪(美国 LI-COR公司)于气候室正常照光3 h后选择从上往下数第3～5片叶位、大小、受光方向一致且完全展开的功能叶片测定其Pn、E、Gs和Ci.测定条件：PAR为1 000 μmol/(m2·s)，固定系统内CO2浓度为400 μmol/mol，相对湿度为60%.

1.2.3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定 碱胁迫处理20 d后，每个处理选取5株长势平均的白柳插条进行测定.测定前将叶片暗适应15 min，然后利用 Pocket PEA 植物效率分析仪(Hansatech，UK)测定其OJIP曲线.将获得的OJIP曲线用于快速叶绿素荧光诱导曲线数据分析(JIP-test)，并对相关参数进行计算[17-19].其中分析计算可得：暗适应后的最大光化学效率(在t=0时)φPo；反应中心捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其他电子受体的激子占用来推动QA还原激子的比率(在t=0时)Ψo；反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额(在t=0时)φEo；用于热耗散的量子比率φDo；以吸收光能为基础的性能指数PIABS；以单位面积为基础的性能指数PICSm；以单位材料面积为基础的推动力DFCSm.

1.3 数据处理

用Excel 2016及Origin 2018进行数据处理及作图，采用SPSS 25.0软件对各项指标数据进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法检验差异显著性(α=0.05).

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对白柳根系生长的影响

试验结果表明碱胁迫下各处理间生根率均可达到100%，但平均根数、平均根长和生根指数在各处理间差异较大，表现为随胁迫加剧，抑制作用加重，且根萌动天数出现延后.

由图1可以看出，在pH值为8.0时白柳的平均根数、平均根长和生根指数均有不同程度的下降，但均未与对照产生明显差异.随碱胁迫程度进一步加剧，使平均根数、平均根长和生根指数逐渐下降，在pH为8.5时，3个指标分别较对照显著下降17.9%、27.2%和9.7%.pH增加到9.0和9.5时，平均根数、平均根长和生根指数下降更加显著.表明随碱胁迫加重，根系萌发与伸长受到明显的抑制作用且愈加强烈.

图1 碱胁迫对白柳插条根系生长的影响Figure 1 Effects of alkali stress on root growth of Salix alba L.cuttings

2.2 碱胁迫对白柳叶片光合参数的影响

由表1可以看出，白柳叶片的光合过程在不同浓度碱胁迫下均受到不同程度的影响，其Pn、E和Gs均随pH值升高而总体呈逐渐下降趋势.溶液pH为8.0和8.5时，白柳叶片的Pn虽有所下降，但与对照无明显变化，当pH达到9.0时，叶片Pn较对照显著降低21.8%，此时碱胁迫显著抑制了白柳叶片的光合碳同化能力.各处理下E和Gs与对照之间的差异均达到显著水平，当溶液pH为8.0时，白柳叶片E和Gs分别较对照显著降低19.5%和13%.叶片Ci随溶液pH升高呈先降后升的变化趋势，在pH为8.5时降到最低，并较对照显著降低9.1%，之后逐渐升高，溶液pH为9.5时，叶片Ci与对照差异不显著，但较最低值显著升高12.8%.

表1 碱胁迫对白柳叶片光合参数的影响

2.3 碱胁迫对白柳叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)的影响

OJIP曲线能够提供丰富的关于PSⅡ的光化学信息，准确反映植物光合机构的状态及光反应中PSⅡ供体侧、受体侧及PSⅡ反应中心电子氧化还原状态[20-21].图2为碱胁迫下白柳叶片OJIP曲线的变化状况.随碱胁迫加剧，白柳叶片快速叶绿素荧光曲线有不同程度的改变，溶液pH为8.0时，I、P点荧光值与对照差异不显著；在pH>8.0的碱胁迫条件下I、P点荧光值显著下降且出现明显拐点K(300 μs左右)，OJIP 曲线变为OKJIP曲线，此时到达最大荧光所需的时间被缩短，表明碱处理浓度越高对白柳叶片胁迫伤害程度越大.

2.4 碱胁迫对量子产额和能量分配比率的影响

由表2可以看出，白柳叶片在不同浓度碱胁迫下吸收、转化、用于电子传递以及以热辐射方式耗散的能量发生明显变化.与对照相比，随碱胁迫加剧，白柳叶片φPo逐渐下降，在pH值为8.5时开始显著低于对照.此时PSⅡ受到伤害，光合机构发生光抑制，这同时也是植物进行光保护的过程.叶片Ψo与φEo均随碱胁迫程度加剧与对照相比呈总体逐渐下降的变化趋势.在pH值为8.0时，叶片Ψo和φEo均未与对照有明显差异，之后随胁迫进一步加剧，Ψo和φEo明显下降，在溶液pH为8.5时，Ψo和φEo分别显著低于对照12.7%和14.3%.与对照相比，碱胁迫显著增加了白柳叶片的φDo，且在溶液pH为8.5时开始显著高于对照.

图2 碱胁迫对白柳叶片快速叶绿素荧光诱导动力学OJIP曲线的影响Figure 2 Effect of alkali stress on the fast induction curves of chlorophyll a fluorescence (OJIP curve) of Salix alba L.leaves

表2 碱胁迫下白柳叶绿素荧光诱导动力学参数变化

2.5 碱胁迫对性能指数及推动力的影响

性能指数和推动力可以准确表达植物光合机构的状态，能较好地反映胁迫对光合机构的影响.由表3可以看出，随碱胁迫程度加剧，PIABS、PICSm和DFCSm总体均呈逐渐下降趋势.PIABS在溶液pH为8.5、9.0和9.5时较对照显著降低了26.5%、40.5%和52.6%；PICSm在溶液pH为8.5、9.0和9.5时较对照显著降低了18.2%、38.0%和46.8%；DFCSm在溶液pH为9.0和9.5时较对照显著降低了4.8%和6.2%.由上述结果可以发现碱胁迫严重影响了植物对光能的吸收并导致基础推动力的下降.

表3 不同碱胁迫下性能指数及推动力的变化

3 讨 论

3.1 碱胁迫对白柳根系生长状况的影响

根系是植物吸收水分和养分的重要器官，同时也是植物进行物质交换的器官之一[22]，对维持植物地上部的生长发育，发挥正常生理功能具有重要意义[23-24].碱胁迫对植物的伤害之所以甚于盐胁迫，主要是由于高pH明显抑制了根系生长，根系因与逆境胁迫直接接触，成为最直接且主要的受害器官.其抑制作用主要表现为根系的长度、表面积等参数处于较低水平，根系生长变慢等.高pH值会通过引起根系周围金属离子和磷的积累沉淀，使根系附近离子失衡，影响其对营养元素的吸收，减少液泡中质子的数量，进而抑制或破坏根细胞跨膜电化学势梯度[25]，导致细胞膜透性增大，造成植物大量失水，最终轻则影响根系生理功能，重则使根细胞解体.破坏根系结构[26]，造成植株根系活力降低，根系吸收功能下降，导致地上部叶片萎蔫，影响光合作用的正常进行，从而使植物生长代谢紊乱甚至丧失生理功能.

根系生长状况的改变以及根萌动时期的早晚能直观反映碱胁迫对植物伤害程度的大小.本研究表明，在较低碱胁迫下(溶液pH为8.0)白柳的平均根数、平均根长和生根指数并未与对照有明显差异，但随碱胁迫程度加剧，根系萌发与伸长受到明显的抑制，根萌动天数出现延后.研究表明白柳根系生长状况在碱胁迫下受到全面抑制，进而影响植物的正常生长发育过程.

3.2 碱胁迫对白柳光合参数的影响

光合作用能为植物的正常生长发育提供物质与能量，且对逆境环境较为敏感[27].碱胁迫通过植物根际高pH胁迫、渗透胁迫、离子毒害及光合产物积累所引起的反馈抑制等途径综合影响光合作用[28]，表现为破坏膜结构从而影响组织细胞内离子分布、影响植物对光能的吸收、电子传递以及碳同化等过程[29]，造成植物代谢紊乱.气孔作为植物叶片与外界联系的通道，直接影响和控制植物的净光合速率和蒸腾速率[30].以往研究表明，逆境胁迫下气孔限制、非气孔限制及二者的相互作用等均会使植物光合速率下降[31-33].气孔因素即是气孔导度下降，CO2进入叶片受阻；非气孔因素主要指光合器官的光合活性下降，包括光合膜系统损伤、光合电子传递能力下降、CO2同化能力下降等[34].若逆境胁迫下植物净光合速率降低时，伴随着气孔导度与胞间CO2浓度的同时降低，说明此时气孔因子是限制净光合速率的主要原因；气孔导度若与胞间CO2浓度未同时降低，则表明净光合速率的降低是由非气孔限制因子所致[35].本试验中，碱胁迫下白柳叶片的净光合速率明显降低，且随胁迫加剧，叶片的气孔导度呈降低趋势.当溶液pH小于8.5时，均有白柳叶片胞间CO2浓度随气孔导度的下降而下降，说明此时气孔限制是白柳叶片光合作用降低的主要原因；但在pH大于8.5处理条件下，白柳叶片胞间CO2浓度随气孔导度下降而升高，说明此时白柳叶片光合器官结构受损，净光合速率降低主要受非气孔限制因素的影响，这与张潭等[36]在枸杞、刘建新等[37]在燕麦上的研究结果类似.

植物在逆境胁迫环境下能否协调好碳同化与水分消耗之间的关系对自身的正常生长至关重要[38].通过控制气孔开度，以在植物得到CO2和失去水分的调节中达到平衡是植物发挥正常生理功能的关键，这在许多研究中被证实[39-40].本研究中，随碱胁迫加剧，白柳蒸腾速率一开始便受到显著抑制，随后净光合速率也明显下降，但净光合速率下降程度明显低于蒸腾速率，表明白柳能在一定程度上提高对水分的利用效率，以此来维持光合速率的相对稳定.这一过程表明白柳对碱胁迫具有一定的调节适应能力，并且这种适应性对植物本身在逆境下的生存和延续具有重要意义.

3.3 碱胁迫对白柳叶绿素荧光动力学的影响

OJIP曲线主要反映了PSⅡ的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化[41].JIP-test数据分析技术目前被广泛应用于植物生理研究.碱胁迫能够直接或间接地影响植物PSⅡ的功能，通过对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的分析，可深入探究环境条件的改变对植物PSⅡ的影响以及光合机构对环境变化的适应机制[41].典型的植物快速叶绿素荧光诱导曲线一般在荧光上升阶段为OJIP曲线.本研究表明，白柳在溶液pH>8.0时荧光曲线变为OKJIP曲线，I、P点荧光值显著下降且出现明显拐点K.K点的出现是由于水裂解系统和QA之前受体侧部分被抑制从而引起PSⅡ供体侧放氧复合体(OEC)受损所导致的，K点的相对可变荧光可作为OEC被破坏的标志[42-43].同时高碱浓度处理极大地缩短了达到P点(最大荧光值)所需的时间，这表明pH越高对白柳叶片PSⅡ供体侧胁迫伤害程度越大，向下游提供电子的能力越弱，PSⅡ受体侧的还原受阻碍程度越强.

φPo、φEo、Ψo、φDo反映了植物的能量分配比率.随碱胁迫加剧，白柳叶片φPo、φEo和Ψo逐渐下降且在pH为8.5时即显著低于对照.说明碱胁迫使光合机构受到明显损伤，PSⅡ受体侧功能受到伤害，QB和PQ被还原的能力下降，QA传递电子的能力以及有活性的反应中心开放程度下降.φDo显著升高，表明光合系统吸收的光能用于光化学反应的占比下降，用于热耗散的量子比率升高，该结论与张会慧等[32]和刘建新等[44]的研究具有一致性.说明此时叶片具有较高的耗散过剩能量的能力，可能通过叶黄素循环耗散掉过剩的激发能以进行光保护[45]，从而调控光合系统能量分配.植物在逆境胁迫条件下易发生或加重光抑制[42],本研究中，随溶液pH升高，白柳PIABS、PICSm和DFCSm均呈现较明显的下降趋势，说明碱胁迫下白柳叶片发生了光抑制，光合机构的功能受到损伤，光能转化效率显著降低，PSII反应中心部分失活，进而限制了其光合作用的正常进行.

4 结论

碱胁迫对白柳根系生长状况、光合作用和快速叶绿素荧光特性均有影响，随着碱胁迫加剧，受害症状表现明显.平均根数、平均根长和生根指数显著降低，根系生长状况受到全面抑制；光合速率显著降低，PSⅡ反应中心部分失活、PSⅡ供体侧OEC与受体侧电子受体受到损伤，这是碱胁迫下白柳叶片光合能力下降的原因之一.但白柳也可通过调节净光合速率与蒸腾速率的下降幅度在一定程度上确保自身蒸腾耗水的利用能力，以提高用于热耗散的量子比率等方法来应对碱胁迫，由此可见白柳对碱胁迫环境表现出一定的适应性和耐受能力.