聚焦PCR技术应用 突破考试难点

唐建烽

摘要 PCR技术是现代生物学研究中常涉及的重要技术，也是高中生物教学的重点和难点。由于高中实验室条件限制，学生缺少实操演习，学习难度大，考试得分率低。通过对考试题目中常见的PCR应用类型进行总结和梳理，希望帮助学生突破学习难点，起到举一反三的作用。

关键词 PCR 应用 基因工程 高中生物

中图分类号 G633.91

文献标志码 B

PCR是一种以特定靶DNA片段为模板，以目的基因特异性碱基序列设计的引物为起点，在耐高温DNA聚合酶催化下，通过反复的高温变性、低温退火、中温延伸等步骤，快速、特异性地体外复制出目的DNA片段的技术。自PCR发明以来，科研人员在此基础上进行了大量改进，开发了适用于不同生物学研究目的的PCR技术，如反向PCR、不对称PCR、实时PCR、数字PCR技术。由于PCR具有敏感、特异、快速、简便等优点，被广泛应用于食品安全检测、疾病检验、遗传病诊断、基因进化研究等领域，对分子生物学的发展产生了深刻影响。在以“真科学考查真素养”为背景下的高考试题中，试题内容多选用前沿科技成果作为素材进行命制，以真实的科研研究创建真实的科学探究情景和研究任务。PCR作为现代分子生物学常用的技术，高考试题经常涉及对PCR技术应用的考查，且考查方法多种多样。

1基因工程操作程序中的应用

这类知识考查的原型是《选择性必修3·生物技术与工程》中有关基因工程基本操作程序的相关知识。PCR技术可用于获取和扩增目的基因、增添酶切位点、检测目的基因是否正向连接等。

1.1获取和扩增目的基因

科学家常用PCR特异性地快速扩增目的基因。RT-PCR是从mRNA获得cDNA并进行扩增的一种实验技术。该技术通常需要提取总RNA，以其中mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板，以目的基因特异性碱基序列设计引物，进行PCR扩增，即可获得大量目的基因。

【例1】乳头瘤病毒（HPV）是一种DNA病毒。可导致人患宫颈癌。科研人员将HPV某外壳蛋白A基因构建成表达载体，经包装或直接注入体内，表达出相应抗原，诱导机体产生免疫反应。该方法获得的疫苗称为DNA疫苗。获取A基因的方法：从宿主细胞中提取总RNA，以与互补的一段单链DNA作为引物，加入逆转录酶获得，然后经PCR扩增获得大量的A基因。

参考答案：A基因转录出的mRNA;cDNA。

1.2增加酶切位点

在构建基因表达载体时，为使目的基因和载体产生相同的末端以便于拼接，需要用同种限制酶切处理二者。实际操作中往往会出现目的基因两侧没有合适的酶切位点，为解决该问题可以在PCR扩增目的基因时，在引物的5′端添加合适的碱基序列从而增加酶切位点。

【例2】（2020·海淀一模）研究人员选取启动子sul准备与图1表达载体连接。图2显示了启动子sul内部存在的酶切位点，箭头表示转录方向。

依据图1，克隆启动子sul时，在其A端和B端应分别添加限制性内切酶的酶切位点，从而确保启动子sul可与已被酶切的表达载体正确连接。

解析：在选择酶切位点时需要注意不能破坏启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构，此外还要注意连接方向，从而保证目的基因的正常表达。由于启动子中含有SmaI和HindIII，因此只能选择SapI和XhoI。由于转录方向为A到B，因此在A端添加XhoI，在B端添加SapI。

参考答案：XhoI和SapI。

1.3目的基因是否正向连接

【例3】（2019·江苏卷）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图3所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图3中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是

解析：根据目的基因插入的位置和PCR技术的原

理分析，PCR扩增时选择的一对引物要位于目的基因的上游和下游，因此只能选择甲丙或者乙丙組合。若选择甲丙组合，无论目的基因是否正确连接，扩增的片段都是450bp，不符合要求;若选择乙丙组合，正向连接可扩增的片段为350bp，若反向连接，因为引物位于一侧，则不可以扩增。根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段（等于300bp+100bp），说明选择的是引物甲和乙，且乙引物应该位于重组质粒的外侧，目的基因发生了反向连接。

参考答案：乙、丙;目的基因反向连接。

1.4目的基因的检测与鉴定

目的基因在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，是转基因成功的重要一步。可以通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞以及检测目的基因是否转录出mRNA。

【例4】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到图4所示的电泳图谱。其中1号为DNA标准样液，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图4所示。据此作出的分析，不合理的是（）

A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间

B.3号样品为不含目的的基因的载体DNA

C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D.10号确定反应体系等对结果没有干扰

解析：PCR技术是基因工程中常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。提取受体细胞的总DNA，以载体为模板进行PCR，之后再进行电泳检测。在设计PCR引物时，最好一个引物与载体DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，并以重组DNA为模板才可获得扩增产物。由图可知，3～8号有扩增条带，分子大小在400bp左右，3号作为参照，应为不含目的的基因的载体DNA。因9号PCR结果无扩增条带，所以不是所需转基因植株。

参考答案：B。

【例5】（2017·石景山一模）DNA拓扑异构酶II在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞。华蟾素注射液处理HepG-2细胞48h后：提取HepG-2细胞中的总RNA，经逆转录形成cDNA，PCR扩增并进行电泳。图5所示电泳条带的宽窄代表。

解析：由于mRNA在组织细胞中的含量很低不易检测且不可以直接扩增，因此需要将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，通过cDNA的扩增量间接反映目的基因的转录水平。

参考答案：TopoII基因转录水平。

2检测突变体基因型

土壤农杆菌的质粒上有一段特殊的DNA区段，在侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上这一段能转移的DNA叫做T-DNA。科学家常利用T-DNA这一特性，用于植物基因功能研究及植物突变体的培育。若明确知道T-DNA插入的位点，可根据插入位点基因及T-DNA特异性核苷酸序列设计引物进行PCR;再进行凝胶电泳，根据电泳条带的差异即可判断基因型是纯合子还是杂合子。

【例6】（2015·海淀一模）为验证F2植株基因型及比例，研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图6所示。

随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“I+III”组合及“II+III”组合进行PCR（完整的T-DNA过大，不能完成PCR），检测是否扩增。若，则相应植株的基因型为Dd;同理可判断其他基因型，进而统计各基因型比例。解析：由图可知，引物II和III分为与D基因的两侧的碱基序列互补，引物I与T-DNA上面的单链碱基互补。由于完整的T-DNA过大，不能完成PCR，D基因只能通过引物“II+III”组合进行PCR扩增，d基因只能通过若引物“I+III”组合进行PCR扩增。因此，若仅引物“II+III”组合可以扩增，则相应植株的基因型为DD;若仅引物“I+III”组合可以扩增，则相应植株的基因型为dd;若引物“I+III”组合及“II+III”组合都可以扩增，则相应植株的基因型为Dd。参考答案：引物“I+III”组合及“II+III”组合均可以扩增。

3诱导基因突变

在PCR过程时，通过设计碱基错配的引物，可以实现对目的基因的定点突变，也可以通过替换基因片段的方式实现基因的突变，从而实现对基因功能的研究。

【例7】（2018·海淀区高三期中）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图7所示方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。图7所示的4次PCR应该分别如何选择图中所示的引物？请填写表1（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。

解析：由题目可知，该方法的主要原理是根据实验目的要求设计碱基错配的引物B和C。以蛋白A基因为模板，引物A和B构建PCR反应体系1。以引物C和D构建PCR反应体系2。将PCR反应产出物1和2混合后构建PCR反应体系3，由于引物B和C碱基序列互补，所以两个PCR产物会连接在一起。在DNA聚合酶的作用下两条单链会沿着5′到3′的方向延伸，从而得到等长的PCR产物3。再以PCR产物3为模板加入引物A和D，构建PCR反应体系4。经过PCR扩增后即可得到实现定点突变的基因片段。

4疾病、食品安全的检测

实时定量PCR是一种检测样品中特定核酸含量的PCR反应。一般使用带有荧光标记的引物，随着PCR反应的进行，荧光信号强度也按照特定的规律随PCR产物不断累积而增加。每经过一个热循环，定量PCR仪通过荧光检测系统接收荧光信号强度，检测PCR扩增后所得产物量。通过连续检测得到的反应动力学曲线，可计算出样品中模板DNA的初始含量。该技术在科研工作中应用广泛，可用于疾病和食品安全的检测、对比相同基因在不同组织中相对表达量等。

【例8】将新冠病毒不稳定的RNA转换成DNA后，技术人员常采用荧光定量PCR技術定量检测样本中病毒的核酸含量。其原理如图9所示，在PCR反应体系中每加入一对引物的同时，加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。反应最终的荧光强度与PCR起始状态的含量呈正相关。

解析：在PCR扩增过程中，Taq酶遇到探针时会使荧光探针水解，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量（病毒样品模板RNA含量）越多，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关。

参考答案：模板DNA。

PCR方法自建立至今，极大地推进了生命科学研究的发展，也定会随着科学技术的发展继续被优化。笔者仅仅是对考试题目中常见的PCR应用类型进行总结，无法完整囊括所有类型的应用，如将PCR用于性别鉴定、动植物DNA分型研究和基因进化研究等。希望通过以上的总结能够帮助学生加深对PCR的理解，对PCR相关题目的解答起到触类旁通的作用。

参考文献：

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