一株分离自德国小蠊的贵州绿僵菌的鉴定及生物学特性

陈名君，汪 婷，卞林猛，林 俨，黄 勃

（安徽农业大学微生物防治省重点实验室，合肥 20036）

蟑螂是蜚蠊目Blattaria昆虫的俗称，大多数栖居野外，少数种栖息室内。德国小蠊Blattaria germanica、美洲大蠊Periplaneta americana、澳洲大蠊P. australasiae、东方蜚蠊Blatta orientalis等一些种类是世界性卫生害虫[1]，其中德国小蠊具有较强的繁殖、扩散和适应能力[2]，是全球最普遍、最难治理的蟑螂种群[3]。它能机械性地携带多种病原菌，导致人类腹泻、痢疾等疾病[4]，同时也给人们正常的生活和工作造成困扰。目前，化学防治仍是杀灭德国小蠊的重要手段，但这种防治方式不仅会造成环境污染、杀伤天敌，而且随着杀虫剂的长期广泛使用，使德国小蠊产生了严重的抗药性[4-6]。因此，亟需寻求对德国小蠊安全有效且对环境友好的防治方法。而微生物防治害虫具有绿色环保、对生态安全、可大规模生产以及可持续控制的优势，所以利用微生物来防治德国小蠊具有良好的前景。

贵州绿僵菌Metarhizium guizhouense属子囊菌门 Ascomycota、粪菌纲 Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科 Clavicipitaceae、绿僵菌属Metarhizium，是一种昆虫病原真菌。郭好礼等[7]从贵州的鳞翅目幼虫上分离到一株绿僵菌，其孢子长度在6.7～7.3 μm，被命名为贵州绿僵菌。其与常见金龟子绿僵菌M. anisopliae的区别在于分生孢子两端稍尖，分生孢子链的连接点明显不在同一中心轴上。Liu等[8]认为贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌M. taii两者形态和同工酶相近，戴氏绿僵菌应为贵州绿僵菌的异名。2006年Huang等[9]测定分析了平沙绿僵菌M. pingshaense、贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌ITS序列，认为这3种绿僵菌都应视为金龟子绿僵菌小孢变种M. anisopliaevar. anisopliae的异名，同时也确认贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌亲缘关系很近。Bischoff等[10]利用多基因分析进一步揭示了整个金龟子绿僵菌支系的系统发育关系，最终将金龟子绿僵菌类群划分为九个种，包括贵州绿僵菌种级分类地位的确定，并正式将戴氏绿僵菌作为贵州绿僵菌的异名来处理。随着该菌分类地位的明确，学者们对该菌也进行了大量的应用研究。申剑飞等[11]研究发现贵州绿僵菌菌株CQM135对花生蛴螬具有良好的防治效果。Narit等[12]研究了利用贵州绿僵菌防治泰国楝树食皮木蠹蛾Cossus chloratus生物防治效果，研究发现利用该菌防治食皮木蠹蛾是一种有效且生态友好的措施。Narit和Aran[13]也研究发现经过贵州绿僵菌处理过的实蝇雄虫可以将该菌传播给未处理的雄蝇和雌蝇，从而可以有效降低实蝇种群。

不同种的绿僵菌寄主专一性有所区别，而且生防菌株存在一定的寄主专化性，在使用绿僵菌生物农药过程中寄主限制问题也尤为突出。因此，正确鉴别绿僵菌菌种，对绿僵菌杀虫剂的研制和开发有着重要的指导意义[18]。不同地理来源、不同寄主来源的菌株在生长速率、产孢能力及致病力等方面都存在很大差异[14]，且只有在适宜的环境下才更容易寄生昆虫[15-17]，所以开展生防菌株生物学特性研究，系统掌握其生物学特性，从而达到更好地利用真菌防治害虫具有重要意义[17]。本试验是利用从安徽省宣城市麻姑山林场采集到的德国小蠊自然罹病虫尸分离得到的一株绿僵菌，进行分离鉴定及保存，并系统研究了其生物学特性，以期为重要的卫生害虫德国小蠊的生物防治提供种质资源和科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯去皮清洗，取200 g切块，加水1000 mL在电磁炉上煮15 min后纱布过滤，滤液中加琼脂15 g，葡萄糖20 g，加热熔化后定容至1000 mL。

PPDA培养基：按PDA培养基配制，加蛋白胨10 g，加蒸馏水定容至1000 mL。

SDAY培养基：葡萄糖40 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，加入蒸馏水定容至1000 mL。

SMAY培养基：麦芽糖40 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，加入蒸馏水定容至1000 mL。

Czapek培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，七水硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，加水定容至1000 mL[3]。

水琼脂培养基：琼脂15 g，蒸馏水1000 mL。

1.3 菌株培养鉴定

将分离得到的一株绿僵菌菌株RCEF6416接到PDA培养基上，25 ℃培养6～14 d，观察菌落形态、生长速率、产孢结构和孢子形态大小等。

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1.4 菌丝制备、DNA提取、EF-1α序列扩增、序列比对及系统发育分析

菌丝制备：将供试菌株接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上于25 ℃培养5 d左右，待产生大量菌丝后，从玻璃纸上刮取菌丝，保存备用。

DNA提取：参照朱衡等[19]的方法提取菌体总DNA，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

EF-1a 序列扩增：反应体系（25 μL：2.5 μL Buffer，0.5 μL dNTP，正反引物各 1 μL，0.2 μLTaq聚合酶和1 μL模板DNA。PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环34次；循环结束后72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后于凝胶成像系统检测拍照并送于北京六合华大基因科技股份有限公司测序。扩增引物EF-1a：983F（5′−GCYCCYGGH CAYCGTGAYTTYAT−3′）、2218R（5′−ATGACACCRACRGCRACRGTYTG−3′）[20]。

序列比对及系统发育分析：将试验菌株序列与GenBank中下载已登录的绿僵菌EF-1a序列信息一起，用BioEdit Sequence Alignment Editor软件分别对基因序列进行比对分析并以fas格式保存，用MEGA 7.0软件将其转换为Nexus文件格式，通过PAUP软件用最大简约法MP构建系统发育树，根据形态和系统进化结果进行物种多样性分析[20]。

1.5 不同培养基对菌株生长速度和产孢量的影响

将分离得到的绿僵菌配制成 1.0×106孢子/mL悬浮液，用微量取样器吸取 2 µL分别接种于 PDA、PPDA、SDAY、SMAY和Czapek培养基中心，在25 ℃恒温培养箱（光周期12L:12D）中倒置培养，每组试验设置5次重复。从第3 d开始，每天测量菌落直径，测横纵直径求取平均值，共观察至14 d。观察结束后，用打孔器（直径1.2 cm）在菌落中心及横纵轴对称位置取5个菌块，置于20 mL 0.05%的吐温- 80无菌水的三角瓶中，磁力搅拌10 min振荡均匀，用血球计数板测定孢子的数量[21]。

1.6 不同盐浓度对菌株生长速度的影响

配置NaCl盐浓度分别为0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和0.25 mol/L的PDA培养基，每组处理设置3次重复。以无NaCl的PDA培养基作为对照组，接种和培养方法同1.5。从第3 d开始每天进行菌落直径测量至14 d。

1.7 不同pH对菌株生长速度的影响

用无菌的稀NaCl溶液和10%的NaOH溶液将PDA培养基的pH分别调成6、7、8、9共4个梯度（中性培养基或碱性培养基先调 pH，灭菌后取出倒平板即可。酸性培养基若灭菌前加入盐酸，在灭菌高温下会与琼脂反应不易凝固，应灭菌后在无菌操作台将pH调至6。每组设置3次重复，接种和培养方法同1.5。从第3 d开始每天进行菌落直径测量至14 d。

1.8 高温胁迫对孢子萌发率的影响

用0.05%的吐温- 80试剂配置浓度为1×106孢子/mL悬浮液，用微量移液器移取3 mL孢子悬浮液于5 mL容积的离心管中，分别置于35 ℃，40 ℃和45 ℃的恒温水浴锅中水浴，各温度下分别处理15 min，30 min，60 min，120 min和240 min。水浴振荡均匀移取20 µL孢子悬浮液均匀涂布在水琼脂培养基上，于25 ℃培养箱中培养20 h后观察。以25 ℃水浴（常温）的孢子悬浮液作为对照组，每组试验设置3次重复，在显微镜下计数，形成菌丝或芽管长度超过孢子50%记为萌发，计算孢子萌发率，每处理重复3次[16]。

1.9 数据统计与分析

菌落直径＝（菌落横径＋菌落纵径）/2；菌落直径日增长量（cm/d）×平均菌落直径/培养天数；每cm2菌落含孢量＝平均每小格孢子数×400×104×稀释倍数/打孔器面积；每mL孢子总量＝80小格内孢子总数/80×400×104×稀释倍数；孢子萌发率（%）＝萌发的孢子数/观察孢子总数×100。

试验数据利用SPSS 20.0软件进行处理和分析[17]。

2 结果与分析

2.1 菌株分离鉴定

从安徽省宣城市麻姑山林场采集到自然感染绿僵菌的德国小蠊僵虫，带回实验室进行分离鉴定，获得一株绿僵菌菌株。该菌株在PDA培养基上25 ℃培养，14 d菌落直径达到30～48 mm。菌落绒毛状或絮状，最初白色，产孢时暗绿色，培养至6 d左右开始产孢。边缘规则平整，背面黄色。菌丝有隔、透明、光滑，直径1.5～3.2 μm。分生孢子梗上多2～3个瓶梗，瓶梗柱形，（8.8～20.1×1.5～3.4）μm。分生孢子单细胞，柱状两端略尖，（4.5～9.5）×（1.9～3.4）μm。单个孢子近无色，成堆时暗绿色，一般在瓶梗上向基性排列成分生孢子链。依据产孢结构特征和分生孢子的大小，初步鉴定为贵州绿僵菌Metarhizium guizhouense（图1）。

图1 贵州绿僵菌形态特征Fig. 1 Morphological characteristics of Metarhizium guizhouense

绿僵菌的EF-1α基因可有效区别金龟子绿僵菌类群中的隐含种，所以我们测定该菌株EF-1α序列。从基于EF-1α基因构建的系统发育树可以看出，从自然感病德国小蠊分离得到的菌株RCEF6416与模式贵州绿僵菌M. guizhouense菌株（CBS258.90）为同一分支，支持率较高（图2）。且在GenBank的序列比对结果，也是和贵州绿僵菌ARSEF6238及其模式M. guizhouense相似度最高，分别达到100%和99.5%。结合形态特征和分子鉴定结果，可以确认德国小蠊感染菌株为贵州绿僵菌。

图2 基于EF-1α基因序列构建的贵州绿僵菌及相近种的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on EF-1α gene sequences of Metarhizium guizhouense and related fungi

2.2 不同培养基对菌株RCEF6416生长速度及产孢量的影响

菌株RCEF6416在不同的培养基上，生长速度区别明显，在PPDA培养基上的生长速度较快，明显快于其他培养基。在PDA、SDAY和SMAY的平均日增量相似，分别为4.40 mm/d、4.43 mm/d和4.34 mm/d；菌株在Czapek培养基上的生长速度最慢，平均日增量仅为3.56 mm/d。在SDAY和SMAY培养基上，初期的生长速度快于后期，菌落生长速度存在一个明显的减速期，其他培养基上的速度相对均匀。菌株RCEF6416在5种培养基上的产孢量差异较大，PDA上的平均产孢量最大为5.1×107孢子/cm2，PPDA次之为1.7×107孢子/cm2，Czapek培养基产孢量最小为1.6×105孢子/cm2（表1）。

表1 贵州绿僵菌RCEF6416在不同培养基条件下的生长情况Table 1 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 under the different culture media

5种不同的培养基上菌落颜色、形状有较大区别，PDA与PPDA菌落颜色呈墨绿色，由内向外菌落颜色逐渐变淡，最外围为白色菌丝；SDAY与SMAY的菌落形态比较类似，两者颜色均为墨绿、黄色与白色交替出现，外围白色菌丝圈较小；SDAY上的产孢量略大于SMAY培养基，所以颜色较深；Czapek培养基上菌落中心为白色，向外依次为墨绿、黄色、白色菌丝，形成一个同心圆（图3）。

图3 贵州绿僵菌RCEF6416在不同培养基条件下的菌落特征Fig. 3 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different culture media

2.3 不同盐浓度胁迫对菌株RCEF6416生长速度及产孢量的影响

本组试验设NaCl浓度为0的PDA培养基为对照组，对照组菌落直径日增量3.46 mm/d。当盐浓度在一定范围内慢慢升高，菌落直径日增长速度也不断增加，在NaCl浓度达到0.20 mol/L时直径日增长速度达到最大，为5.24 mm/d，相对增速（与盐浓度为0的PDA相比）为51.4%；当NaCl浓度达到0.25 mol/L时，菌落直径日增量呈下降趋势，为5.18 mm/d。

NaCl浓度为0时的产孢量最大，为4.5×107孢子/cm2，这与不同培养基上菌株产孢量试验中PDA上的结果基本一致。在NaCl浓度为0.15的培养基上有一定的上升趋势，但随着盐浓度的增加，产孢量下降趋势明显（表2）。

表2 贵州绿僵菌RCEF6416在不同NaCl浓度下的生长情况Table 2 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different NaCl concentration

随着NaCl浓度的上升，菌落的直径逐渐增大，当NaCl浓度达到0.20 mol/L时最大，NaCl浓度为0.25 mol/L时略有下降。在不同盐浓度下，菌落的颜色存在变化：NaCl浓度为0时，菌落中心有黄色气生菌丝产生，菌落墨绿色，由内向外逐渐变淡，最外围是白色菌丝体；NaCl浓度为0.10 mol/L时，菌落的颜色较第一组浅；NaCl浓度为0.15 mol/L时，菌落颜色变化特殊，在外围过渡到白色菌丝时有一条颜色加深的环形区，这一区域的产孢量较大；NaCl浓度为0.20 mol/L时，菌落特征与第2组相似，但产孢区更小，白色菌丝区更大；NaCl浓度为0.25 mol/L时，菌落颜色最浅，产孢量最小，可以看到明显的菌丝延伸（图4）。

图4 贵州绿僵菌RCEF6416菌株在不同盐浓度下的菌落特征Fig. 4 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different salt concentration

2.4 不同pH对菌株RCEF6416生长速度及产孢量的影响

在微酸或微碱环境培养基上，菌株的生长速度都会有所加快，在pH为7的培养基上，菌落直径日增量最小，为3.37 mm/d；在pH为8的培养基上，菌落直径日增量最大，为4.99 mm/d；当pH为9时，菌落直径日增量再次下降，为4.32 mm/d。从表3的数据可知，pH为8时产孢量最大，为4.3×107孢子/cm2，几乎是pH为7时（2.1×107孢子/cm2）的两倍。pH为6和pH为9的产孢量数值接近，因此可知将培养基调成微碱，可提升菌落的产孢量（表3）。

表3 贵州绿僵菌RCEF6416在不同pH下的生长情况Table 3 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different pH value

pH中性或偏酸时培养基孢子分布不均匀，培养基呈现的颜色比较杂乱；而在培养基成碱性时，中心处气生菌丝增多，变成黄色，培养基上孢子分布较为均匀，由内向外产孢量降低的速率很明显，菌落呈多个同心圆式分布（图5）。

图5 贵州绿僵菌RCEF6416菌株在不同pH培养基条件下的菌落特征Fig. 5 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different pH medium

2.5 高温胁迫对孢子萌发率的影响

本组试验每处理3次重复，每重复显微镜下观察300个孢子，以菌丝长度超过孢子长度1/2为萌发标准，计算孢子萌发率。以 25 ℃水浴（常温）处理下孢子为对照组，对照组的孢子萌发率在不同时间段均约为95.2%。处理温度越高，孢子萌发率越低，同一温度水浴时间越长孢子萌发率越低。35 ℃处理4 h后孢子萌芽率为65.6%；40 ℃时15 min水浴处理孢子萌发率为64.3%，而处理4 h后孢子萌发率只有11.2%；45 ℃水浴处理孢子萌发率下降最快，处理15 min和处理4 h孢子萌发率分别为23.5%和2.6%（图6）。

图6 高温胁迫对贵州绿僵菌RCEF6416孢子萌发率的影响Fig. 6 High temperature stress on spore germination rate of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416

3 讨论

绿僵菌属真菌寄主广泛，已被用于防治多种农林害虫[21-23]。该属的分类地位经过多年的研究已趋于完善，但仅从形态结构鉴定绿僵菌菌种还存在一定困难，结合分子生物方法可对其进行准确鉴定。Bischoff等[24,25]分析了EF-1α、RPB1、RPB2和β-tubulin共4个核基因序列，并结合部分菌株产孢形态学特征，获得了更合理的绿僵菌分类系统，且得到了同行研究者的普遍认可。本研究从德国小蠊僵虫体壁分离出的绿僵菌，经形态学结构特征和EF-1α基因序列的比较及与相关种的系统发育树建立，确定德国小蠊的分离菌株为贵州绿僵菌。

研究表明，同一种绿僵菌不同来源的菌株，其生物学特性和致病力都存在明显差异[26,27]。因此，一种生防菌株在生产应用前，系统掌握其生物学特性具有重要意义[20]。本试验研究了分离自德国小蠊的贵州绿僵菌RCEF6416在培养基PDA、PPDA、SDAY、SMAY和Czapek上的生长情况和产孢能力。研究发现在PPDA培养基上的生长速度较快，但在PDA培养基上产孢量最大。可见，营养成分在菌株生长发育过程中具有重要作用，只有丰富而且合适的营养条件才有利于菌丝生长以及大量产孢[17]。另外，不同盐浓度、不同 pH以及不同高温处理也是影响绿僵菌生长发育的重要因素[28]。本研究发现，在一定范围内，随着盐浓度增加菌落直径日增量不断增加，但是产孢量逐渐下降，且菌落逐渐产生较大的白色菌丝圈。当pH为8时，菌株生长速度最快，产孢量最大，这一结果与于永浩等[29]、刘思雨等[17]研究金龟子绿僵菌的最适pH为7差异较大。这可能是不同绿僵菌菌株、不同菌株对酸碱环境适应性不同。而在研究不同高温水浴对该菌株孢子萌发率影响时发现，当水浴温度为45 ℃处理4 h后，其孢子萌发率仅为2.6%。可见，高温对贵州绿僵菌孢子活力影响很大，因此在储运贵州绿僵菌孢子时一定要避免高温。

利用贵州绿僵菌防治农林业害虫的研究还不多见，更未见利用该菌防治卫生害虫的相关报道。本研究中分离得到的贵州绿僵菌RCEF6416分离自德国小蠊，在人工培养条件下，可快速生长并能大量产孢，因此对卫生害虫德国小蠊的生防制剂的开发具有良好潜力。本试验尚未开展该菌株对德国小蠊的侵染致病能力的研究，下一步将深入研究其致病性，为该菌株的开发利用提供可靠的科学依据。