苏云金杆菌G033A对化学农药防治草地贪夜蛾的减量效应

胡 飞，徐婷婷，胡本进，毕思佳，佟 强，徐丽娜*，张 杰

（1. 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，合肥 230031；2. 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种源于美洲热带、亚热带地区的重大迁飞性害虫[1]。2019年入侵我国并迅速蔓延至全国26个省/市/自治区，成为严重威胁我国玉米生产的重大害虫[2]。化学药剂因具有杀虫速度快、使用方法简便等特点，被普遍应用于我国草地贪夜蛾应急防控。尤其是甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate，简称甲维盐）和氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole）因对草地贪夜蛾具有较高杀虫活性[3-5]，其单剂和复配剂成为全国各地防治草地贪夜蛾的主打药剂。

然而，草地贪夜蛾在入侵我国前已经历了漫长的化学防治过程，抗性相关基因检测发现，入侵我国的群体对传统有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类农药具有较高的抗性基因变异频率，目前虽尚未检测到对新型酰胺类农药的抗性基因突变位点，但田间种群对氯虫苯甲酰胺的敏感性也有所下降[6,7]。而波多黎各草地贪夜蛾田间种群已对氯虫苯甲酰胺产生160倍的高水平抗性，对甲维盐亦产生低水平抗性[8]。目前，我国对草地贪夜蛾执行分区治理策略，在其周年繁殖区不断有虫源迁入、繁殖，为减少虫源外迁，玉米的生长周期内往往需多次用药；迁飞过渡区和重点防范区为压低迁入虫口基数、降低危害，应用化学防治也是不可避免的防治手段。而草地贪夜蛾作为一种迁飞性昆虫，抗性种群的抗性等位基因会持续存在[9]，大量长期使用某种化学药剂，使其处于巨大的选择压力之下，势必导致抗性的产生。尽快制订并实施科学合理的综合治理和抗性治理策略，延缓抗药性的产生，是草地贪夜蛾可持续防控的当务之急[10]。

微生物药剂与化学药剂混配使用是近年来减少化学药剂使用量，缓解抗药性产生的重要手段。其中，苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是应用范围最广、使用量最大、防治最成功的微生物杀虫剂，它与化学药剂混用，不仅可以有效防控对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素产生抗性的小菜蛾，而且可以减少化学药剂的使用量[11]。中国农业科学院植物保护研究所研制的苏云金杆菌 G033A对鳞翅目、鞘翅目叶甲科害虫均具有较高毒力，已由武汉科诺生物科技股份有限公司登记生产。2020年11月获批扩作登记用于草地贪夜蛾防治，在安徽宣城、河南新乡、广西南宁等地进行了春玉米、夏玉米和秋玉米草地贪夜蛾防治田间应用，整体防治效果都达到80%以上[12]。然而与化学药剂相比，速效性差、用药量大是苏云金杆菌不可忽视的缺陷。为了减少化学药剂使用量、延缓抗药性的产生，同时进一步提高生物农药利用率，本研究通过室内生测和田间试验测定了减量 G033A和低剂量化学药剂混配对草地贪夜蛾的防治效果，以期为生物农药的推广和应用技术提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

苏云金杆菌G033A（简称G033A）可湿性粉剂（商品名：禁卫军®），由武汉科诺生物科技股份有限公司提供，有效成分含量32000 IU/mg，防治草地贪夜蛾的推荐用药量150～300 g/667 m2，本次试验中选用推荐最低剂量的50%作为联合试验中G033A的使用量。5%甲维盐水分散粒剂（WG），河北中保绿农作物科技有限公司提供；200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂（SC），由美国富美实公司提供；15%甲维盐·氯虫苯甲酰胺悬浮剂（SC），安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所自研。

1.2 供试虫源

用于室内生物测定的草地贪夜蛾系 2019年采自安徽省黄山市春玉米田，在室内以人工饲料长期饲养的实验室种群，饲养过程中未接触任何杀虫剂。饲养条件为（27±1）℃，光周期14L:10D，相对湿度60%±10%。选择虫体一致，健康的3龄初幼虫进行测试。

1.3 G033A联用化学药剂室内生测

根据各化学药剂在草地贪夜蛾或其它鳞翅目害虫上的推荐使用量，分别设置0.2 g/L、0.3 g/L、0.3 g/L为甲维盐、氯虫苯甲酰胺和甲维盐·氯虫苯甲酰胺的参考试验浓度，并以此为基准设置化学药剂减量25%、50%和75%共12个药剂单独处理。在配制好的化学药剂溶液中，按照浓度1.5 g/L加入G033A，充分混匀后配制成化学药剂和G033A混剂共12个处理；并以相同浓度G033A单独使用为对照（表1）。

表1 室内生物活性测定中苏云金杆菌G033A与化学药剂联用配方表Table 1 Compound formula of Bacillus thuringiensis G033A and pesticides in bioassay

采用浸叶法进行生物测定，选取展开的幼嫩玉米叶片，剪成1.5 cm×1.5 cm大小，在配制好的不同处理药液中浸渍10 s，待其自然晾干后放入垫有湿润滤纸的12孔培养板中，每孔放入4片叶片。然后将饥饿处理6 h的供试幼虫接入培养板中，每处理12头，重复6次。

1.4 G033A联用化学药剂对草地贪夜蛾的田间防治试验

试验在安徽省农业科学院岗集试验基地（117º22′ E，30. 96′ N）进行，试验田块地势平坦，土层深厚，中上等肥力，土壤肥力较均等，有机质含量一般，玉米于2020年7月3日播种，每667 m2定植约3500株，株距0.35 m，行距0.5 m，田间肥水管理等条件一致，符合当地农业生产实践，面积约4000 m2。选择草地贪夜蛾发生严重时开展试验。

试验共设14个处理（表2列举13个），每处理4次重复，小区采用随机区组排列，每小区面积约30 m2，玉米定株120株左右，小区间设1 m宽保护行，药剂用量见表2。于2020年8月6日茎叶喷雾施药1次。田间草地贪夜蛾发生虫态大多为卵～低龄幼虫期，试验前未施用任何农药，玉米百株受害率为60%～70%。采用背负式电动喷雾器对准叶心重点喷施，用水量为 50 L/667 m2。

表2 苏云金杆菌G033A与化学农药联用配方表Table 2 Compound furmula of Bacillus thuringiensis G033A and chemical pesticides

1.5 调查方法

室内生物测定，接虫后每24 h观察一次幼虫存活状态，连续观察3 d，以软毛笔轻触虫体不动判定为死亡。以清水为对照，记录死亡幼虫数量和存活幼虫数量，并据此计算幼虫校正死亡率。

田间药效试验，分别于药后 5 d、10 d、15 d 各调查一次，每个处理随机取5点，每点20株玉米，施药前调查玉米植株上草地贪夜蛾数量。虫口减退率和防治效果如下公式，试验数据采用SPSS 21.0进行差异显著性分析。

虫口减退率（%）＝（施药前活虫数—施药后活虫数）/施药前活虫数×100；防治效果（%）＝（处理区虫口减退率—空白对照区虫口减退率）/（100—空白对照区虫口减退率）×100。

2 结果与分析

2.1 G033A与减量化学药剂联合应用对草地贪夜蛾幼虫存活的影响

处理后24 h，甲维盐参考剂量（0.2 g/L）及减量25%、50%和75%单独使用，草地贪夜蛾3龄幼虫校正死亡率分别为99.07%、87.04%、85.19%和80.56%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率分别为100.00%、99.07%、91.67%和87.96%，结果表明：甲维盐减量与G033A联合使用的幼虫校正死亡率显著高于其减量单独使用（P＜0.05）。处理后48 h，甲维盐参考剂量（0.2 g/L）及减量25%、50%和75%单独使用，草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率分别为100.00%、94.44%、97.22%和86.11%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率均为100.00%，甲维盐减量与G033A联合使用的幼虫校正死亡率均显著高于其减量单独使用（P＜0.05）。处理后72 h，甲维盐各剂量单独使用及与G033A联合使用，幼虫校正死亡率均为100.00%，处理间差异不显著（图1）。

图1 G033A与不同剂量5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水分散粒剂联合应用对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率Fig. 1 Effects of G033A combined with different dose of 5% emamectin benzoate WDG on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

处理后24 h，氯虫苯甲酰胺参考剂量（0.3 g/L）及减量25%、50%和75%单独使用，草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率分别为20.37%、11.11%、6.48%和1.85%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率分别为58.33%、25.93%、23.15%和8.33%，氯虫苯甲酰胺与G033A联合使用的幼虫校正死亡率均显著高于其单独使用（P＜0.05）。处理后48 h，氯虫苯甲酰胺推荐剂量（0.3 g/L）及减量25%、50%和75%单独使用，草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率分别为70.37%、63.88%、39.81%和30.55%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率分别为92.59%、76.85%、75.93%和72.22%，氯虫苯甲酰胺与G033A联合使用的幼虫校正死亡率均显著高于其单独使用（P＜0.05）。处理后72 h，氯虫苯甲酰胺各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率均为 100.00%；而其单独使用时，只有参考剂量处理幼虫校正死亡率为 100%，其他各减量处理幼虫校正死亡率均显著低于相应联合用药（图2）。

图2 G033A与不同剂量200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂联合应用对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率Fig. 2 Effects of G033A combined with different doses of 200 g/L chlorantraniliprole SC on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

处理后24 h，甲维盐·氯虫苯甲酰胺参考剂量（0.3 g/L）及减量25%、50%和75%单独使用，草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率分别为68.52%、66.67%、60.19%和27.78%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率分别为83.33%、77.78%、63.89%和41.67%，甲维盐·氯虫苯甲酰胺各浓度与G033A联合使用的幼虫校正死亡率均显著高于其单独使用。处理后48 h，甲维盐·氯虫苯甲酰胺参考剂量及减量25%、50%和75%单独使用，幼虫校正死亡率分别为87.96%、87.96%、73.15%和61.11%；各剂量与G033A联合使用，幼虫校正死亡率分别为100.00%、98.15%、83.33%和71.30%，甲维盐·氯虫苯甲酰胺各浓度与G033A联合使用的幼虫校正死亡率均显著高于其单独使用。处理后72 h，甲维盐·氯虫苯甲酰胺与G033A联合使用的各处理，幼虫校正死亡率均为 100.00%，而其单独使用时，只有参考剂量和减量 25%处理幼虫校正死亡率为100%，减量50%和75%使用，幼虫校正死亡率显著低于与G033A联合用药处理（图3）。

图3 G033A与不同剂量15%甲维盐·氯虫苯甲酰胺悬浮剂混配对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率Fig. 3 Effects of G033A combined with different doses of 15% emamectin benzoate chlorantraniliprole SC on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

浓度为1.5 g/L的G033A单独处理24、48和72 h后，幼虫校正死亡率分别为0.00%、38.89%和72.22%，其与本试验中的三种化学药剂联合使用相同时间后，幼虫校正死亡率均显著高于其单独使用。

2.2 G033A与减量化学药剂联合应用对草地贪夜蛾的田间防治效果

G033A防治草地贪夜蛾最低推荐剂量（150 g/667 m2）单独施用5 d、10 d和15 d，对草地贪夜蛾的田间防效分别为 35.97%、59.21%和 52.57%。甲维盐、氯虫苯甲酰胺和甲维盐·氯虫苯甲酰胺参考剂量（5、15、20 g/667 m2）单独施用5 d、10 d和15 d，对草地贪夜蛾的田间防效分别为82.18%、71.03%和44.43%；81.02%、83.83%和77.89%；91.16%、87.61%和83.44%。甲维盐与G033A联合使用可以提高甲维盐的持效性，甲维盐减量25%、50%和G033A联合施用15 d后，对草地贪夜蛾的防效分别为66.77%和70.64%，显著高于药剂参考剂量单独施用的防效，甲维盐减量75%和G033A联合使用后，对草地贪夜蛾的防效仍高于甲维盐参考剂量单独施用，只是差异不显著。氯虫苯甲酰胺及甲维盐·氯虫苯甲酰胺与G033A联合使用，其速效性和持效性均可改善，二种药剂分别减量25%、50%和G033A联合使用5 d和15 d后，对草地贪夜蛾的防效均高于其参考剂量单独施用，只是差异不显著（表3）。

表3 G033A与低剂量化学杀虫剂混配对草地贪夜蛾的防治效果Table 3 Effect of G033A mixed with low dose chemical insecticides on Spodoptera frugiperda

3 讨论

苏云金杆菌因杀虫效果佳、特异性强、无残留、对非靶标生物安全等特点成为目前推广最为广泛的生物杀虫剂，苏云金杆菌 G033A作为我国获批的第一个转基因抗虫工程菌对草地贪夜蛾、黄曲条跳甲等鳞翅目和鞘翅目昆虫均展现出较高毒力[13]。而且，近年来病原微生物与化学杀虫剂混配使用成为减少药剂使用量，缓解抗药性产生的重要手段，现有研究表明，苏云金杆菌与茚虫威、阿维菌素等多种杀虫剂复配具有增效作用，而且其与其它生物杀虫剂或化学杀虫剂混配使用已在实际生产中不断推广，表现出防效增加、持效期延长、抗药性延缓等特点[14-21]。本次试验通过室内生测和田间试验全面测定了G033A分别与5%甲维盐、200g/L氯虫苯甲酰胺、和15%甲维盐·氯虫苯甲酰胺减量75%、50%和25%及常规用量联合使用对草地贪夜蛾的防治效果，证明不仅草地贪夜蛾的死亡率明显上升，而且显著提高了低剂量化学农药的杀虫速率。田间亩施用G033A（75 g）＋5%甲维盐（5 g）、G033A（75 g）＋200 g/L氯虫苯甲酰胺（11.25 g）、G033A（75 g）＋15%甲维盐·氯虫苯甲酰胺（15 g）、G033A（75 g）＋15%甲维盐·氯虫苯甲酰胺（10 g）均对草地贪夜蛾具有较好的防治效果。可见，G033A与特定化学药剂联用具有协同增效作用。常以共毒系数评价混配化学农药的增效作用，然而对于微生物与化学杀虫剂的混合应用，它们之间可能并不是直接加和，共毒系数不能如实反映协同效果[22]。应参考农药共毒系数评价方法，结合 G033A杀虫特点，以至少减量50%农药与G033A混用后保持害虫致死率和明显缩短LT50为协同增效指标，测定共毒指数（CTLT50），以评估协同增效作用[23]。以此为基础，进一步开展 G033A与不同药剂的联合应用试验，明确增效作用，筛选最佳增效配比，以为菌药复配制剂的开发提供支持。

G033A克服了苏云金杆菌杀虫谱窄的缺陷，然而见效慢、使用量大、对高龄幼虫活性低等缺点仍然存在。本研究进行的室内试验以3龄幼虫为对象，田间防治时虫源亦多为低龄幼虫，而实际生产中草地贪夜蛾常以各种龄期幼虫混合发生，而且高龄幼虫因具有暴食性，破坏力更为巨大，针对高龄幼虫的防治效果有待进一步研究；另外选取的化学药剂种类有限，后续还需开展多种药剂与 G033A联合使用，进一步研究 G033A对化学农药防治草地贪夜蛾的减量效应。玉米全生育期伴有多种鳞翅目害虫混发，如棉铃虫、玉米螟、粘虫、甜菜夜蛾等，针对G033A与化学农药联合使用防治玉米主要害虫技术还需开展深入研究。