老年慢性便秘患者肠道菌群结构特点的研究*

李 菁 邹晓平 王钟晗 高苏萌 方 榕

南京市中心医院消化科1(210018) 南京大学医学院附属鼓楼医院消化科2 上海市第六人民医院消化科3

慢性便秘是老年人常见的消化系统疾病，全球约1/3的老年人长期受便秘的困扰[1]。我国总体便秘患病率为3%～11%，60岁以上老年人患病率显著升高，为15%～20%[2]。慢性便秘患者的生活质量明显下降，且因症状持续影响患者的精神心理状态，甚至可能导致严重并发症，如粪便嵌塞、排便失禁、心脑血管疾病发作、乙状结肠扭转等[3]。目前认为肠道菌群数量、种类的改变以及细菌的代谢分子等均在慢性便秘的发病过程中起有重要作用。Khalif等[4]的研究发现成年慢性便秘患者肠道乳杆菌和双歧杆菌数量显著降低。产甲烷菌丰度增加可协助诱导并加重慢传输型便秘[5]。目前尚未见关于我国老年慢性便秘患者肠道菌群变化的系统性研究。本研究通过采用16S rRNA检测老年慢性便秘患者与健康老年人的肠道菌群，旨在探讨老年慢性便秘患者肠道菌群结构的特点。

对象与方法

一、研究对象

纳入2019年1月—2019年12月于南京市中心医院就诊的老年慢性便秘患者30例，其中男性12例，女性18例；年龄60～80岁，平均(71.17±6.81)岁。纳入标准：①年龄≥60岁；②符合罗马Ⅲ标准中慢性便秘诊断标准[6]；③排除肠道器质性疾病以及内分泌和神经系统疾病。排除标准：①患有恶性肿瘤者；②存在心脏衰竭、肾衰竭者；③有严重未控制的其他疾病或急性感染者；④过去8周内接受过抗菌药物或益生菌治疗；⑤患者不能理解研究目的或不同意研究的要求。以同期30名健康老年人作为对照，其中男性16名，女性14名；年龄60～79岁，平均(68.43±5.10)岁。入选者均取得知情同意，本研究方案由南京市中心医院伦理委员会批准。

二、方法

以无菌容器收集入选者晨起第1次粪便15～20 g，2 h内置于-80 ℃冰箱中密封保存。提取粪便样本中微生物基因组，选择细菌16S rRNA V3～V4区对应的引物进行扩增，引物区包含与测序仪结合的P5、P7序列、区分不同样本的barcode序列、测序引物序列、与细菌16S基因保守区结合的序列。用Qiagen胶回收试剂盒，进行PCR产物的纯化，并用NanoDrop和Qubit分别进行文库定量。按照每个样品10万条测序序列(reads)的数据量，加入合适的文库量，选择NextSeq CN500进行PE150测序。原始下机数据首先采用FastQC软件进行质量检测，得到有效序列后进行序列拼接，拼接后将其与16S参考数据库作比对，去除嵌合体序列，将过滤后的序列以97%相似度的序列组成一类操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)，1个OTU代表1个物种。根据OTU聚类分析进行物种注释，最后进行生物信息学分析。上述测序和生物信息学分析均由上海宝藤医学检验所有限公司完成。

三、统计学分析

采用SPSS 25.0统计学软件。Alpha多样性分析采用独立样本t检验。Beta多样性分析通过ANOSIM分析比较菌群特征，LEfSe基于线性判别分析(LDA)和STAMP分析评估组间物种差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、构建稀释曲线

健康组和慢性便秘组所有样本的稀释曲线均趋于平坦，曲线平坦说明测序数据合理(图1)。

图1 健康组和慢性便秘组所有样本的稀释曲线

二、肠道菌群的Alpha多样性分析

与健康组相比，慢性便秘组Ace、Chao、Shannon和Simpson指数均无明显差异(图2)。

图2 慢性便秘组和健康组的Alpha多样性分析

三、肠道菌群的物种组成分析

慢性便秘组和健康组OTU数量分别为5 284个和5 855个，其中两组相同的OTU为1 579个。两组均获得优势菌属20种，均占所有菌属的80%以上，其中拟杆菌属均为丰度最大的菌属。健康组普雷沃菌属、粪杆菌属、毛螺菌属相对丰度比例更高；而慢性便秘组瘤胃球菌属、志贺菌属、Para-bacteroides、Alistipes相对丰度比例更高(图3)。

图3 健康组和慢性便秘组肠道菌群属水平分布图

四、肠道菌群的Beta多样性分析

使用PCoA的形式展示两组物种组成之间的接近程度，ANOSIM分析结果显示慢性便秘组与健康组的菌群特征相比差异有统计学意义(R=0.098，P=0.001；图4)。

图4 健康组和慢性便秘组肠道菌群的PCoA和ANOSIM分析

五、肠道菌群的物种差异分析

采用LEfSe方法筛选出两组差异显著的物种,结果显示健康组相对丰度占优势的菌群物种有25个，慢性便秘组有2个，分别为g_Alistipes、f_Rikenel-laceae(图5)。健康组和慢性便秘组在≥3个层级水平相对丰度占优势的菌群物种分别为4个和0个。

图5 健康组和慢性便秘组显著差异物种LDA值分布柱状图和物种分支进化图

采用STAMP分析两组肠道菌群属水平的差异，结果显示与健康组相比，慢性便秘组Alistipes、颤螺菌属、瘤胃球菌属和Parabacteroides菌属相对丰度更高(P<0.05)，巨球型菌属相对丰度更低(P<0.05；图6)。

图6 健康组和慢性便秘组属层级菌种平均比例和差异比较

讨 论

肠道菌群是一个巨大而复杂的生态系统，其相互制约并相互调控[7]。肠道菌群与多种疾病相关，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病、肠易激综合征、慢性便秘、结肠肿瘤等[8-9]。肠道菌群可能通过改变数量和种类、调整肠道运动以及免疫调节等方面参与慢性便秘的发病过程[10]。本研究通过纳入老年慢性便秘患者与健康老年人，留取粪便进行测序，以期找到两组人群肠道菌群结构的差异。

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和多样性的指标。丰富度包括Ace指数和Chao指数，多样性包括Shannon指数和Simpson指数。本研究结果显示两组的Ace指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数均无明显差异，提示老年慢性便秘患者和健康老年人在肠道菌群的种类和数量以及各自菌群的多样性方面无明显差异。进一步Beta多样性分析发现，两组肠道菌群组成有明显差异，两组中仅1 579个OTU相同，且PCoA相似性分析结果显示两组的物种组成不相近。在属层级水平，两组前20种优势菌属在组成上无差异，但两组中相同菌属的相对丰度比例存在差异，慢性便秘组普雷沃菌属、粪杆菌属和毛螺菌属相对丰度较健康组减少，而瘤胃球菌属、志贺菌属、Parabacteroides、Alistipes相对丰度则增多。

本研究进一步通过LEfSe方法筛选出两组相对丰度存在差异的物种，结果显示健康组相对丰度占优势的菌群物种有25个，而慢性便秘组仅2个，健康组在≥3个层级水平相对丰度占优势的菌群物种为4个；应用STAMP分析属层级的菌群物种差异，结果显示慢性便秘组Alistipes、颤螺菌属、瘤胃球菌属和Parabacteroides菌属相对丰度显著高于健康组，而巨球型菌属相对丰度更低。

肠道菌群的多样性是反映肠道微生物稳态的重要指标，慢性便秘患者肠道菌群数量以及种类较健康人存在明显的差异[11]。慢性便秘儿童的粪便菌群多样性与健康儿童亦不同[9]。有研究指出，老年人的肠道菌群种类和数量下降[12]。黄林生等[13]的研究发现慢性功能性便秘患者肠道菌群多样性与健康组无明显差异，肠道菌群丰度差异有统计学意义。本研究中老年慢性便秘患者的肠道菌群丰度和多样性与健康老年人相比无明显差异。两组菌群种类和数量无差异可能是老年人菌群种类、数量下降后在合并便秘情况下无进一步显著下降所致。既往研究显示成人慢性便秘患者的双歧杆菌属和乳杆菌属数量显著减少[4]，儿童慢性便秘患者双歧杆菌和梭杆菌数量未见明显减少，普雷沃菌属数量明显下降[9]。本研究中两组菌群物种组成存在明显差异，但老年慢性便秘患者双歧杆菌属无明显变化，而普雷沃菌属数量明显下降，结论与儿童便秘患者相同。黄林生等[13]的研究发现慢性功能性便秘组中Parabacteroides和拟杆菌属显著富集；Parthasarathy等[14]发现结肠慢传输型便秘患者结肠黏膜中拟杆菌属显著增高。本研究中仅观察到慢性便秘组Parabacteroides增加。肠道微生态制剂对便秘有缓解作用。动物实验表明双歧杆菌可通过增加便秘小鼠模型肠黏膜5-羟色胺受体4表达的能力来促进肠蠕动，从而改善便秘。同时，双歧杆菌还可改变肠道菌属的相对丰度，为肠道微生态制剂治疗慢性便秘提供了理论依据[15]。

总之，老年慢性便秘患者肠道菌群的多样性与健康老年人无差异，而物种组成存在明显差异。但这些菌群物种的差异在慢性便秘发病过程中所起的作用目前仍不明确，需行进一步的深入研究。如何从这些菌群物种差异中成功找到关键的致病菌群并应用于临床治疗老年慢性便秘患者值得进一步的研究。