利用蚕虫草培育过程的优化以提高虫草素产量的研究进展＊

钱赵裔，陈玉银

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310030）

1 引言

《本草从新》中记载：“冬虫夏草，四川嘉定府所产者最佳，云南、贵州所产者次之。冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化为草。”自古以来，冬虫夏草因其严苛的生长环境要求、稀少的产量和重要的药用价值而价值千金。即便是到了现代，冬虫夏草的人工培育技术仍未取得满意的结果，冬虫夏草的产量少，所以价格也一直是居高不下。

在市场上有一类不那么昂贵的“虫草”，即蛹虫草，又叫北冬虫夏草、北虫草、蛹草。这两者的共同之处在于具有相似的生物学活性成分，有些品种的形态相似，所以在生活中经常有人将二者混为一谈，但其实二者还是有很大差异的。蛹虫草和冬虫夏草虽然都是子囊菌门，肉座目，麦角菌科，虫草属的真菌，但是冬虫夏草是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫的尸体的复合体，寄主专一，而蛹虫草的真菌类型更多，且寄体多样；冬虫夏草的形成条件需要高海拔，生境严苛，中华冬虫夏草更是中国所特有的，而天然的蛹虫草虽然产量不高，但是它全球性分布，而且人工蛹虫草栽培技术的成熟更是大大提高了其产量。

因为冬虫夏草的人工培育十分困难，并且由于环境的破坏，野生虫草的产量也在下降，所以人们对蛹虫草的人工栽培技术进行了全方位的研究。而蚕虫草—一种由蛹虫草菌寄生于家蚕幼虫身上并产生子实体的一种虫菌复合物［1］—因其寄主最易大规模饲养、其形态最接近冬虫夏草、其药用价值很高等特点，被认为是“野生冬虫夏草最佳的替代品［1］”，因而对蚕虫草的研究也成为热点之一。

在冬虫夏草和蚕虫草中都含有虫草素（cordyce⁃pin），即3’-脱氧腺苷（3’-deoxyadenosine），是重要的生物活性成分之一，也是衡量冬虫夏草和蚕虫草产品质量的重要指标之一，具有重要的药用价值，并且蚕虫草中的虫草素比在冬虫夏草中的含量高出了数倍［1～4］。由于野生虫草的产量下降，冬虫夏草又难以人工培育来扩大产量，在具有寄体易大规模饲养、虫草素等生物活性成分含量高的优势下，蚕虫草的规模化、工厂化、品质化受到十分的关注，关于如何提高蚕虫草中虫草素含量的问题也有较多的研究，本文将就如何通过优化蚕虫草培育过程以提高蚕虫草中虫草素产量的问题进行分析、总结和讨论。

2 虫草素

2.1 理化性质

虫草素，属嘌呤类生物碱，分子式为C10H13N5O3，相对分子质量为251.24，熔点为230℃～231℃，碱性，针状或片状结晶，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为260 nm［5］，其结构式如图1所示。

图1 虫草素的结构式Fig.1 Structural Formula of Cordycepin

2.2 生物活性

虫草素具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤、抗疲劳、免疫调节、降血脂、减肥、治疗白血病等作用［1～2、6～8］，在新型冠状病毒肺炎的防治中也可起到积极作用［9］，具有多种药理作用，在生物医药及保健食品领域具有广阔的应用前景［7］。

2.3 主要来源

①化学方法合成；②从天然虫草或人工培育的虫草子实体或其子座中提取；③筛选高产虫草素的优良虫草菌株，通过液态培养等方法发酵产生虫草素，从菌丝体和发酵液中分离纯化提取虫草素［10］。

2.4 蚕虫草中的分布

虫草素在蚕虫草中主要分布在子实体和蚕体，也即整体都有，但其在子实体和蚕体中的含量多少有所差别，但是并不绝对。在申鸿等的研究中，子实体的虫草素高于蚕体，而在孙迎节等的研究中结果却相反，其可能的影响因素是多样的，比如家蚕品种、菌种品种和培育环境等［6］。但主要还是从子实体中提取。

2.5 提取方法

微波辅助法、超声辅助法、超临界萃取法、加速溶剂萃取法和纤维素酶辅助法［7、11］。

2.6 测定方法

主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-ESI/MS）法及薄层色谱扫描法等，最常用的为高效液相色谱法［5］。

3 通过优化蚕虫草培育过程提高虫草素产量的方法

3.1 优化蛹虫草菌株选育

若要获得高产虫草素的菌株，一般在自然状态获取的蛹虫草菌株中筛选是十分低效的，因为自然分离得到的菌株一般虫草素产量不高，而更加有效的方法是对其进行诱变育种以筛选出高产菌株［5］。诱变的方法有化学诱变、辐射诱变、航天诱变和超声诱变等［5，10］，可单独使用，也可复合使用。

在曹照平［10］的研究中，联合使用了超声诱变和化学诱变，成功获得了双重营养缺陷型突变株，其提高虫草素产量的机理在于嘌呤核苷酸的代谢途径的改变，有目的地阻断蛹虫草菌的代谢途径，使其核酸代谢流向积累虫草素的方向。但其实高产菌株的选育研究主要是应用于液体培养途径，而不是蚕虫草的虫草素提取途径，笔者认为，若要应用于蚕虫草的虫草素提取途径，需要考虑蚕寄体所能提供给菌体的营养成分，而显然，这些营养成分的组成是难以像调整液体培养基中的营养组成一样的可以针对性改变的，因此诱变选育的方法更适用于液体培养发酵产生虫草素的途径。而从蚕虫草中提取虫草素的途径中，最佳菌种的筛选需要考虑蚕的感染率最高的菌株，毕竟整体上蚕虫草的虫草素产量和成功感染虫草菌的概率正相关。

3.2 优化接种菌株方案

通过接种方案的优化来提高蚕的感染率，从而提高虫草素的产量。首先是接种的蚕幼虫（本文考虑的蚕寄体仅活体蚕幼虫，不考虑死体蚕）的不同龄期（龄期指每次蜕皮的间隔时间）选择，最佳时间为5龄2 d～4 d［2］，这种接种时间下的蚕感染效果最好，杂菌感染的情况最少。其次是接种方法的选择，可选择的有添食、体喷、穿刺、注射［12］等，常用的接种方法有液体菌种注射法和液体菌种穿刺法，在不同的研究中注射法与穿刺法的相对优劣情况不同，但使用最广泛的的还是注射法［4］。

3.3 优化培育条件

3.3.1 灭菌方法优化

灭菌方法有化学试剂（如75%的酒精、84消毒液）、紫外杀菌和高温灭菌，其中化学试剂法和紫外杀菌法用于活体蚕的灭菌。由于化学试剂杀菌会对蚕的活力和杂菌感染情况造成较大影响，而高温灭菌会造成蚕体内一些有效成分的破坏，所以效果最佳的是紫外灭菌法。

3.3.2 前期培养温度优化

前期培养是指在蚕幼虫接种虫草菌后的一段时间培养，在前期培养阶段，温度与蚕体的抵抗力、生长速率和蚕体内杂菌的生长速度等相关，首先，在温度过低的情况下，蚕易死亡，且虫草菌的生长速度十分缓慢；在温度过高的情况下，家蚕体内的杂菌生长速度将远快于虫草菌，虫草菌感染失败。故此，可以想见，在温度由低到高的变化下，感染率将先升后降，在中间的某一温度将达到最佳条件。在王蕾［1］的研究中，家蚕在7℃的前期培养温度下的感染率最高。

3.3.3 注射量的优化

注射量过低将难以感染蚕体，一旦结蛹，感染失败；注射量过高将使蚕体过早死亡，失去蚕体对杂菌的抵抗力后杂菌大量繁殖，蚕体腐烂，感染失败。在不同的情况（比如不同菌株）下，最佳注射量有所不同，在顾寅钰等［12］的研究中0.05 ml～0.1 ml最佳，而在王蕾［1］的研究中0.3 ml～0.4 ml最佳。因此最佳注射量需要通过在具体条件下的多次试验得到。

3.3.4 培养土的优化

在覆土培育蚕虫草的条件下，培养土的种类和含水量可能通过影响蚕体流出液体中杂菌的生长和蚕体的生长而影响感染率和出草率。

3.4 优化干燥条件

在蚕虫草的生产环节中，干燥是一个重要的环节，研究发现干燥条件的不同会影响蚕虫草活性成分的含量，由于干燥条件涉及含水率和干燥速率等，其可能会对虫草素的保存造成影响，从而影响虫草素的含量。在顾寅钰等［13］的研究中发现微波干燥优于烘干。

4 总结与讨论

蚕虫草优化培育会直接或间接地提高蚕虫草虫草素的产量，任何优化方案都需要经过在特定条件下的单一变量试验才能确定，但各种优化范围具有一定的普适性。

在本综述中，笔者只专注于基于蚕虫草培育优化来提高蚕虫草中虫草素产量的方法，但实际上，单纯就虫草素而言，目前，天然和人工培养虫草子实体的生长周期长，培养件复杂且不易控制，子实体中虫草素含量只有0.2%～0.6%，提取效率不高，而且具有一定的季节性局限，制约虫草素进一步研究和开发利用；而液体发酵生产周期短，发酵过程容易控制，产物获得目的性强，还可以对液体发酵条件进行优化，提高虫草素的产量，因此，液态发酵产虫草素的途径己经慢慢发展为虫草素的主要来源之一［10］。因此，若就虫草素而言，作者认为对如何提高虫草素产量的这一问题的研究价值并不高。

在菌种诱变选育方面，这与虫草素的生物合成途径息息相关。随着蛹虫草菌基因组的全测序完成，以及虫草素生物合成途径的前期研究进展［14］，我们可以展望通过基因工程来简化虫草素的获取方法并提高虫草素的产量或扩大虫草素生产规模。