家蚕中肠内对辛硫磷耐受性细菌的筛选与鉴定＊

张洪滔 ，朱清宇 ，李 兵，2，李凡池，2＊

（1.苏州大学 基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2.苏州大学 蚕桑研究所，江苏 苏州 215123）

昆虫肠道细菌及其功能的研究是当今农林昆虫的研究热点之一，一系列的研究揭示了肠道细菌重要的生态学功能［1，2］，如改善宿主昆虫的营养吸收［3，4］、解除杀虫剂的毒害［5］、抵御病原菌和天敌的入侵［6，7］、合成昆虫信息素等［1，8］。宿主昆虫与其中肠微生物之间相互依存，相互影响，相互制约。遗传证据表明，细菌和真菌到家蚕的大规模水平基因转移，可能增加家蚕（Bombyx mori）的存活和繁殖力，并表明微生物在家蚕进化中的重要作用［9］。众所周知，昆虫肠道微环境影响肠道微生物群落的结构和肠道微生物群的结构和多样性，以及它们的代谢活动，可能在昆虫中具有生理效应。

昆虫生活在农田、野地和森林中，不可避免的会受到来自天敌、农药等方面的侵害。昆虫的肠道微生物除了可以促进宿主的营养吸收，还能够防御环境中所遇到的天敌、病原微生物等生物因素的入侵［10］。茶长卷蛾（Homona magnanima）的肠道微生物对抑制外界环境中苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）的入侵有显著的作用［11］；欧洲熊蜂（Bombus terrestris）的肠道中存在对抗寄生虫的细菌，这些细菌能显著减少寄生虫的数量［12］，表明肠道微生物有助于保护宿主昆虫免受寄生虫和病原菌的危害。另外，肠道菌群还可以在农药和重金属等非生物因素入侵宿主后，发挥解毒作用。家蚕肠道微生物中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugino⁃sa）能有效地降解杀虫剂，鞘氨醇单胞菌属（Sphin⁃gomonas）有增加杀虫剂抗性的作用［13］；豆绿蝽象（Aspongopus chinensis Dallas）肠道中的伯克霍尔德菌（Burkholderia）可以降解毒害宿主的农药杀螟硫磷［14］。Cheng等人研究发现桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）共生菌柠檬酸杆菌属（Citrobacter sp.）的磷酸水解酶基因在敌百虫降解中起着关键作用［5］。这些研究表明肠道共生菌介导的杀虫剂降解在宿主杀虫剂抗性方面起着重要的作用。

家蚕是一种重要的经济昆虫。家蚕经过长期的定向选择，家蚕对野外不良环境（如紫外线、高温、化学农药等）的抗性较弱［15］。在中国，每年农田治虫、化学农业污染桑叶都会对以桑叶为主要饲料的家蚕的生存产生严重的危害［16］。微量农药中毒引起家蚕不结茧已经成为影响我国蚕丝业健康发展的重要因素。辛硫磷是一种经典有机磷农药，在世界绝大部分地区都被广泛使用，农药残留在桑叶上的情况时有发生，而辛硫磷具有广谱性，对非靶标昆虫也存在危害［17］。随着辛硫磷的广泛使用，不少昆虫产生了抗药性，增加了害虫防治的难度［17］，而许多肠道微生物能降解农药，增加宿主对农药的抗性［5］，宿主肠道内特殊菌群的变化可能与农药抗性之间存在密切关系。家蚕幼虫的肠道中存在着大量的细菌群落［18］，尚未有研究报道家蚕肠道内是否存在一些辛硫磷耐受菌。本试验对家蚕肠道辛硫磷耐受性细菌进行分离和鉴定，并对其辛硫磷抗性能力进行测定，期望通过辛硫磷耐受菌提高家蚕对辛硫磷的抗性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试农药

辛硫磷（CAS：14816-18-3，纯度≥98%）购自Sigma公司。使用1 mL丙酮将100 mg辛硫磷原药溶解为100 mg/mL的原液，使用丙酮将原液稀释10倍成工作液（10 mg/mL），再将工作液用双蒸水稀释成为终浓度为1.0 μg/mL的辛硫磷溶液。

1.1.2 供试家蚕品种

品种为“菁松×皓月”，购置于江苏东台市蚕种场。

1.2 试验方法

1.2.1 辛硫磷杀虫剂抗性菌的筛选与生物学鉴定

选取5龄第3 d家蚕，用70%的乙醇进行体表消毒，并用灭菌的0.7%盐水冲洗，再进行解剖。将中肠转移到装有0.7%盐水的灭菌离心管中，碾碎，稀释100倍。加入辛硫磷浓度为100 mg/L的改良基础盐培养基中（基础培养基MM：NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0，加入100 mg/L的辛硫磷作为碳源），于30℃条件下，200 r/min摇床上培养5 d，以1%的接种量接入到相同的培养基中，传代3次。然后取0.5 mL富集液梯度稀释，取细胞数为105，106，107，108个/mL的稀释液各0.1 mL涂布于加有100 mg/L辛硫磷的LB培养基平板上，30℃条件下培养3 d后，发现部分单菌落的周围有黄绿色水解圈，挑取此单菌落接种于LB培养基的试管中，以1%接种量取细菌悬液接种到加有100 mg/L辛硫磷的基础盐培养基中，于30℃条件下，在200 r/min摇床培养3 d。

对于能够以辛硫磷为唯一碳源生长的细菌，采用DNA提取试剂盒提取DNA，用细菌16S rDNA通用引物 8F（5’-GCGGATCCGCGGCCGCTGCAGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′）-1492R（5’-GGCTC⁃GAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增其16s rRNA基因片段，并测序。测序结果分别与EzBioCloud数据库中的模式菌株和GenBank数据库中的序列进行比对，确定各细菌的种和分类地位。

1.2.2 抗性菌的生测分析

将筛选出的耐受菌在LB液体培养基中过夜培养12 h（30 ℃，200 rpm），将50 mL稀释至光密度（OD600=0.4）的细菌培养物以4500 rpm离心5 min，并使用50 mL ddH2O将细菌沉淀重悬，然后均匀地喷洒在50 g桑叶表面，对照组则使用ddH2O喷洒后晾干。在5龄起蚕时，将家蚕分为对照组和不同耐受菌处理组，分别使用处理过的桑叶对家蚕幼虫进行饲养。并收集家蚕粪便进行菌落培养，对生长出的菌落进行检测鉴定，确保耐受菌定殖成功。Peng等人的研究表明辛硫磷对5龄第3 d家蚕的半致死浓度（LC50）（24 h）是 7.86 μg/mL［19］，本研究中选用了1.0 μg/mL作为实验浓度。将新鲜的桑叶浸入1.0 μg/mL的辛硫磷溶液或ddH2O中1 min后，室温晾干。在5龄第3 d使用辛硫磷溶液处理过的桑叶喂食实验组幼虫，对照组使用ddH2O处理。每个实验组30头家蚕幼虫，并设置3组重复，分别记录家蚕幼虫的体重和存活率。

2 结果

2.1 筛选具有辛硫磷耐受性的菌种

将辛硫磷作为改良基础盐培养基中唯一的碳源，筛选对辛硫磷具有耐受性的菌株。然后通过平板划线法培养菌群，挑选其中的单菌落再次培养后进行测序分析、序列比对得出各菌株的序列号以及相似程度，结果汇总在表1中。筛选出了7种对辛硫磷具有耐受能力的菌种，包括鞘氨醇单胞菌（Sphin⁃gomonas spp.）、微杆菌（Microbacterium spp.）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri spp.）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens spp.）、不动杆菌（Acinetobacter spp.）、密歇根克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis spp.）和烟草节杆菌（Arthrobacter nicotianae spp.）。

表1 筛选出的具有辛硫磷耐受性的菌株序列Table 1 Sequence of Phoxim-tolerant Bacteria Screened out

2.2 家蚕取食辛硫磷耐受菌后的体重变化统计

5龄起蚕开始连续添食家蚕辛硫磷耐受菌处理的桑叶2 d，各处理组均未出现死亡蚕。由表2可见，处理1 d对照组家蚕平均体重1.22±0.10 g/头蚕，B4处理组最低为1.14±0.17 g/头蚕，B7处理组最高为1.50±0.13 g/头蚕；处理2 d对照组家蚕平均体重1.73±0.23 g/头蚕，处理组中B4组家蚕平均体重最低，为2.06±0.24 g/头蚕，B5组家蚕平均体重最高，为2.28±0.20 g/头蚕，处理组家蚕体重呈现高于对照组家蚕的趋势。

表2 家蚕取食辛硫磷耐受菌后的体重统计分析Table 2 Statistical Analysis on the Body Weight of the Silkworms Fed with Phoxim-tolerant Bacteria （单位：g/头蚕）

2.3 辛硫磷耐受菌处理后家蚕对辛硫磷的抗性检测分析

5龄起蚕连续添食家蚕辛硫磷耐受菌处理的桑叶2 d后，开始连续添食家蚕1.0 μg/mL辛硫磷处理的桑叶。由表3可见，7种辛硫磷耐受菌处理后的家蚕在辛硫磷持续暴露下，体重均高于对照组家蚕。辛硫磷暴露96 h后，处理组中B2组家蚕平均体重最低，为4.04±0.31 g/头蚕，B5组家蚕平均体重最高，为4.36±0.44 g/头蚕。

表3 辛硫磷耐受菌处理后家蚕暴露在辛硫磷下的体重变化统计分析Table 3 Statistical Analysis on Body Weight Changes of Silkworms Exposed to Phoxim after Treatment with Phoxim-tolerant Bacteria （单位：g/头蚕）

检测辛硫磷耐受菌处理后的家蚕暴露在辛硫磷下的存活率情况。由表4可见，在24 h、48 h、72 h和96 h，对照组的存活率分别为86.67%、70.00%、53.33%和26.67%，而B1处理组家蚕存活率为96.67%、90.00%、83.33%和76.67%，B3处理组家蚕存活率为96.67%、93.33%、90.00%和86.67%，B6处理组家蚕存活率为90.00%、86.67%、80.00%和73.33%。B1、B3和B6三种辛硫磷抗性菌处理后的家蚕暴露在辛硫磷下的存活率均明显高于对照组。

表4 辛硫磷耐受菌处理后家蚕暴露在辛硫磷下的存活率统计分析Table 4 Statistical Analysis on Survival Rate of Silkworm Exposed to Phoxim after Treatment with Phoxim-tolerant Bacteria

3 讨论

目前已明确昆虫对杀虫剂的抗性机制包括表皮穿透率下降、靶标抗性以及代谢抗性，其中代谢抗性机制较为普遍，如细胞色素P450酶（P450s）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）等重要解毒酶系［20］。人为提高昆虫对杀虫剂的抗性包括：抗性品种的选育，靶标基因突变和转基因等手段。本研究中，家蚕取食几种辛硫磷耐受菌处理的桑叶2 d后，体重未出现降低或者死亡的情况，表明几种辛硫磷耐受菌对家蚕无毒害作用。辛硫磷处理后，7种辛硫磷耐受菌处理后的家蚕在辛硫磷持续暴露下，体重均高于对照组家蚕。鞘氨醇单胞菌、松鼠葡萄球菌和密歇根克雷伯氏菌3种辛硫磷抗性菌处理后的家蚕暴露在辛硫磷下的存活率均显著高于对照组，表明这3种辛硫磷耐受菌能提高家蚕对辛硫磷的耐受性。粘质沙雷氏菌在一些昆虫中是一种条件致病菌，虽然能够耐受辛硫磷，但在宿主昆虫受到杀虫剂胁迫下可能会造成致病危害［21］。微杆菌、不动杆菌以及和烟草节杆菌处理的家蚕暴露在辛硫磷下存活率与对照组相似或者略高于对照组。这3种菌在体外实验中对辛硫磷有耐受能力，但是在体内实验中未能达到显著的作用，可能是该菌种在家蚕体内缺乏有效的作用条件，限制了降解辛硫磷的能力。本实验表明可以通过添加辛硫磷耐受细菌来提高家蚕对辛硫磷的耐受性。

肠道微生物与杀虫剂互作可能增强宿主对杀虫剂的抗性。在肠道微生物与化学农药相关性的研究中发现，伯霍尔德杆菌（Burkholderia）能够有效介导点蜂缘蝽（Riptortus pedestris）对杀螟松的抗性［14］。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）有增加家蚕对杀虫剂抗性的作用［13］。假单胞菌能够介导草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）对杀虫剂抗性，如溴氰菊酯和多杀菌素［22］。本研究中鞘氨醇单胞菌、松鼠葡萄球菌和密歇根克雷伯氏菌3种辛硫磷耐受菌是否能够提高家蚕对其它有机磷类杀虫剂，甚至其它类型杀虫剂的耐受性值得进一步研究。