缬沙坦对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞活性损伤的干预作用

蔡承敏何玉茂余亚东

(九江市中医医院, 江西 九江 332000)

糖尿病肾病是糖尿病最严重的微血管并发症之一。 它已经成为终末期肾病发展的主要危险因素[1]。 但是,糖尿病肾病的发病机理尚未完全确定,并且尚无用于预防和治疗糖尿病肾病发生的药物,这已成为世界范围内公共卫生的负担。 最近,肾小球系膜细胞功能障碍已被证明在糖尿病肾病的发病机制中起着至关重要的作用[2]。 缬沙坦(valsartan, Val)是血管紧张素II 受体拮抗剂抗高血压类药物,对糖尿病大鼠足细胞损伤具有显著的保护作用[3],通过上调骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的表达发挥保护糖尿病肾病的功能[4]。在糖尿病小鼠肾小球组织中,缬沙坦影响NOTCH1信号通路表达[5]。 尽管缬沙坦的临床使用有所增加,但其对糖尿病肾病治疗作用的潜在机制仍不清楚,需要进一步研究。 作为高度保守的信号调节剂,NOTCH 信号通路在诸如细胞增殖,分化,凋亡和成熟等生理过程中起着重要作用[6]。NOTCH1 蛋白是NOTCH1 蛋白家族中具有代表性的受体,其下游细胞内结构域被认为是治疗各种肾疾病的关键靶标[7]。 根据上述研究结果,推测缬沙坦对糖尿病肾病治疗作用与NOTCH1 信号传导途径有关。 因此,当前的研究建立了高葡萄糖(HG)诱导的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 损伤模型,模拟糖尿病肾病来对细胞增殖、周期和凋亡进行评估,采用不同浓度缬沙坦干预细胞,并结合NOTCH1 信号通路,以确定缬沙坦对糖尿病肾病治疗作用的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 购自美国模式培养物保存中心(ATCC)。

1.2 主要试剂

缬沙坦购自北京诺华制药公司,Dulbecco's modified eagle medium(DMEM 培养基)购自美国Gibco 公司；NOTCH1 信号通路激活剂Jagged 1/Fc融合蛋白购自于美国R＆D System 公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)购自上海君瑞生物公司；噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自美国Sigma 公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白质分析试剂盒、细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；兔抗细胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗体、兔抗活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗体、兔抗Bcl-2 相关X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体、兔抗B 细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗体、兔抗jagged1 抗体、兔抗NOTCH1 抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗购自上海艾博抗公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养,并置于饱和湿润、37℃、5% CO2的培养箱中生长。

1.3.2 细胞分组与处理

将HBZY-1 分为NC 组(即对照组,未处理的细胞),HG 组(即模型组,30 mmol/L 葡萄糖处理细胞48 h),Val 1 μmol/L 组(1 μmol/L 缬沙坦处理细胞48 h),HG+Val 0.01 μmol/L 组(30 mmol/L 葡萄糖和0.01 μmol/L 缬沙坦处理细胞48 h[8]),HG+Val 0.1 μmol/L 组(30 mmol/L 葡萄糖和0.1 μmol/L 缬沙坦处理细胞48 h),HG+Val 1 μmol/L 组(30 mmol/L 葡萄糖和1 μmol/L 缬沙坦处理细胞48 h),HG+Val+PBS 组(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L缬沙坦和与激活剂等量的PBS 处理细胞48 h),HG+Val+ Jagged 1/Fc 组(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L 缬沙坦和终浓度为2 μg/mL NOTCH1 信号通路激活剂Jagged 1/Fc 融合蛋白处理细胞48 h[9])。 其中,缬沙坦使用培养基配制出0.01、0.1、1 μmol/L 的浓度。

1.3.3 Western blot 检测CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1 和NOTCH1 的表达

收集不同处理的HBZY-1,在RIPA 缓冲液中进行蛋白的抽提。 使用BCA 蛋白质分析试剂盒对蛋白定量。 然后取50 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳。蛋白分离后,转至聚偏二氟乙烯膜,然后用5%脱脂奶粉封闭膜2 h。 随后将膜与Ⅰ抗在4℃孵育过夜,并与HRP 标记的Ⅱ抗(1 ∶5000)室温孵育2 h。 Ⅰ抗包括抗CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1、NOTCH1(均为1 ∶1000 稀释)和抗β 肌动蛋白(β-actin)(1 ∶2000 稀释)。 通过增强的化学发光系统显影、曝光。 以β-actin 为对照,采用凝胶成像分析各蛋白的表达水平。

1.3.4 MTT 比色法检测细胞增殖活力

各组HBZY-1 经不同的处理后,分别在96 孔板中接种24 h、48 h 和72 h。 接下来,每孔细胞中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液,并继续孵育。 4 h 后,加入200 μL 的二甲基亚砜充分溶解反应结晶。 在Bio Tek 酶标仪读取450 nm 的吸光度,以实验组与对照组吸光度的比值表示细胞的增殖活力。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期与凋亡

各组HBZY-1 经不同的处理后,根据细胞周期检测试剂盒的指示,收集1×105个细胞,经70%冷乙醇固定后,加入500 μL PI/RNase A 染色工作液,避光孵育30 ～60 min,于流式细胞仪检测波长488 nm 处的红色荧光,分析细胞周期。 遵循Annexin VFITC/PI 试剂盒的规程,HBZY-1 使用binding buffer重悬,收集1×105个细胞,加入5 μL Annexin VFITC 混匀和5 μL PI 工作液混匀,之后遮光反应15 min,通过FACSCalibur 流式细胞仪评估细胞凋亡。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 22.0 软件进行统计与分析,计量资料表示为平均数±标准差()。 两组间数据比较采用t检验,多组间数据比较用单因素方差分析,组间多重比较用SNK-q检验,P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 缬沙坦促进高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 增殖

MTT 检测结果见图1。 与NC 组相比较,Val 1 μmol/L 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 24 h、48 h和72 h 的增殖活力无显著变化(P＞0.05),而HG 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的增殖活力明显降低(P＜0.05)。 与HG 组相比较,HG+Val 0.01 μmol/L 组、HG+Val 0.1 μmol/L 组和HG+Val 1 μmol/L 组HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的细胞增殖活力显著升高,且呈浓度依赖性(P＜0.05)。

2.2 缬沙坦促进高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 细胞周期

Western blot 和流式细胞术检测结果见图2。 与NC 组相比较,HG 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1中CyclinD1 蛋白表达显著降低,G0-G1 期细胞比例明显增加,S 期细胞比例显著减少(P＜0.05),G2-M期细胞比例无明显变化(P＞0.05)。 与HG 组相比较,HG+Val 0.01 μmol/L 组、HG+Val 0.1 μmol/L组和HG+Val 1 μmol/L 组HBZY-1 的CyclinD1 蛋白表达和S 期细胞比例显著升高,G0-G1 期细胞比例明显降低,且呈浓度依赖性(P＜0.05),同时,G2-M期细胞比例无显著变化(P＞0.05)。

图1 缬沙坦促进高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 增殖Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 1 Valsartan promoted the proliferation of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 after high glucose treatment

图2 缬沙坦促进高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1(48 h)细胞周期和CyclinD1 蛋白的表达Note.A, Flow cytometry to detect the cell cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1.B, Western blot to detect the expression of CyclinD1 protein.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 2 Valsartan promoted the cell cycle and CyclinD1 protein expression in rat glomerular mesangial cells HBZY-1 (48 h) treated with high glucose

2.3 缬沙坦抑制高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 凋亡

Western blot 检测和流式细胞术检测结果见图3。 与NC 组相比较,HG 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达水平明显增加,Bcl-2 蛋白表达水平显著减少,细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)。 与HG 组相比较,HG+Val 0.01 μmol/L 组、HG+Val 0.1 μmol/L 组和HG+Val 1 μmol/L 组Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达水平显著降低,Bcl-2 蛋白表达水平明显升高,细胞凋亡率显著减少,均呈浓度依赖性(P＜0.05)。

2.4 缬沙坦抑制高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 NOTCH1 信号通路

Western blot 检测结果见图4。 与NC 组相比较,HG 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 中jagged1和NOTCH1 蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。 与HG 组相比较,HG+Val 0.01 μmol/L 组、HG+Val 0.1 μmol/L 组和HG+Val 1 μmol/L 组jagged1 和NOTCH1 蛋白表达水平明显降低,且呈浓度依赖性(P＜0.05)。

图3 缬沙坦抑制高糖处理大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 凋亡Note.A, Western blot detection of valsartan inhibits the expression of HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in rat glomerular mesangial cells treated with high glucose for 48 h.B, flow cytometry detection of rat kidney HBZY-1 apoptosis of mesangial cells.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 3 Valsartan inhibited the apoptosis of HBZY-1 glomerular mesangial cells in rats treated with high glucose

2.5 NOTCH1 信号通路激活剂部分逆转缬沙坦对高糖处理的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 的增殖和细胞周期的影响

Western blot 检测、MTT 检测和流式细胞术检测结果见图5。 与HG+Val+PBS 组相比较,HG+Val+Jagged 1/Fc 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 的NOTCH1、jagged1 蛋白表达水平明显升高,CyclinD1蛋白表达水平降低,且24 h、48 h 和72 h 的细胞增殖活力明显降低,G0-G1 期细胞比例显著增加,S 期细胞比例明显减少(P＜0.05),G2-M 期细胞比例无显著变化(P＞0.05)。

2.6 NOTCH1 信号通路激活剂部分逆转缬沙坦对高糖处理的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 凋亡的影响

Western blot 检测和流式细胞术检测结果见图6。 与HG+Val+PBS 组 相 比 较,HG+Val+Jagged 1/Fc 组大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低, 且细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)。

3 讨论

图4 Western blot 检测大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 jagged1 和NOTCH1 蛋白的表达Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 4 Western blot detected the expression of HBZY-1 jagged1 and NOTCH1 proteins in rat glomerular mesangial cells

临床上,糖尿病肾病具有多种症状特征,例如蛋白尿。 作为肾小球的固有细胞之一,肾小球系膜细胞在糖尿病肾病的发病机理中发挥着重要的作用[9]。 越来越多的证据已经确认,肾小球系膜细胞凋亡有助于蛋白尿的加重和糖尿病性肾小球硬化的发展[10]。 因此,确定导致肾小球系膜细胞凋亡的可能机制对于深入了解糖尿病肾病的发病机理是十分必要的。 本研究实验结果表明,大鼠肾小球系膜细胞暴露于高糖条件下可导致细胞增殖减少,阻滞细胞周期,且细胞凋亡增加[11]。 而缬沙坦的处理可以减轻高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞损伤,并且,可以抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞中NOTCH1 信号通路活性,证明了缬沙坦在预防或治疗糖尿病肾病方面的潜力。

缬沙坦是临床常用的降血压药物,此外,其在糖尿病肾病中的功能得到了广泛关注。 各种研究已经证明,缬沙坦可以保护高糖刺激的肾小球足细胞或系膜细胞损伤,产生治疗糖尿病肾病的功效[12-13]。 目前的研究评估了缬沙坦在高糖损伤大鼠肾小球系膜细胞中的作用。 与HG 模型组相比,0.01、0.1、1 μmol/L 缬沙坦干预细胞48 h 后,细胞的增殖活力、S 期细胞比例、细胞增殖相关蛋白CyclinD1 蛋白表达明显增强,G0-G1 期细胞比例、细胞的凋亡率、促凋亡蛋白Bax、凋亡执行蛋白酶Cleaved caspase-3 蛋白表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2 表达显著提高。 当前研究的结果表明,缬沙坦对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 损伤表现出治疗作用。 值得注意的是,缬沙坦的浓度越高,其治疗效果越显著。

图5 NOTCH1 信号通路激活剂部分逆转缬沙坦对高糖处理的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 的增殖和周期的影响Note.A,MTT detection of cell proliferation activity.B,Western blot detection of rat mesangial HBZY-1 jagged1,NOTCH1,CyclinD1 protein expression.C, Flow cytometry detection of rat mesangial cells HBZY-1 cell cycle.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 5 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the proliferation and cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

图6 NOTCH1 信号通路激活剂部分逆转缬沙坦对高糖处理的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 凋亡的影响Note.A, Flow cytometry to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 apoptosis.B, Western blot to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 6 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the apoptosis of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

NOTCH 信号通路在维持进化过程中起着高度保守的信号调节系统的作用,并在细胞的正常增殖和分化中发挥重要作用。 在脊椎动物中,配体(Delta-like 或Jagged 蛋白)激活跨膜受体NOTCH1-4。 激活后,NOTCH 细胞内结构域(NICD)的切割允许其易位至细胞核,从而通过途径核效应子RBPJ激活目标基因,例如HES bHLH 转录因子[14]。 该通路的失调与多种疾病有关,包括糖尿病肾病。 越来越多的研究检测到,糖尿病肾病中NOTCH1 信号传导途径转导的异常激活[15]。 在糖尿病肾病的病理过程中,高血糖和血液动力学改变会诱导NOTCH信号通路的jagged1 配体和NOTCH1 受体表达增加,从而导致受体结构发生改变[16]。 一些研究已证明,阻断NOTCH1 信号传导途径对糖尿病肾病是一种有效的治疗策略[17]。 本研究表明,不同浓度的缬沙坦均可抑制高糖诱导的NOTCH1 信号通路活性,降低jagged1、NOTCH1 蛋白表达,并呈浓度依赖性,与文献[5]报道的缬沙坦降低糖尿病小鼠肾小球组织中jagged1、Notch1 表达的结果相同。 进一步的研究发现,NOTCH1 信号通路激活剂Jagged 1/Fc 融合蛋白处理细胞后,缬沙坦对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 增殖、周期的促进作用被部分逆转,其对细胞凋亡的抑制作用也被部分逆转。 由此可见,缬沙坦可以保护大鼠肾小球系膜细胞免受高糖诱导的损伤,其潜在机制是通过抑制NOTCH1 传导途径来实现的。

综上所述,0.01、0.1、1 μmol/L 浓度的缬沙坦可以浓度依赖性的促进高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖和周期,并抑制期凋亡,其发挥保护作用的机制与抑制NOTCH1 信号通路活性有关,这为糖尿病肾病治疗药物的开发提供了新的途径和依据。